《Journal of Applied Polymer Science》：Polylimonene Improves the In Vivo Wound Healing Performance of Sodium Alginate-Based Hydrogels
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本文推荐一种基于甲基丙烯酰化海藻酸钠（AlgMA）并负载3%聚柠檬烯（PLM）的光交联水凝胶，其通过调控伤口氧化微环境显著促进大鼠切除性伤口愈合。该水凝胶表现出最快的愈合动力学（Logistic速率常数0.63 day?1，半最大愈合时间6.02天），组织学分析证实其能增强上皮再生、肉芽组织密度及真皮重组。PLM作为一种稳定、非挥发性抗氧化剂，有效克服了柠檬烯的不耐久性，为急性伤口护理提供了可持续的生物活性添加剂方案。
1 引言
伤口愈合是一个涉及止血、炎症、增殖和重塑四个重叠阶段的复杂动态过程。每个阶段受细胞、细胞因子和细胞外基质组分间相互作用的精密调控。这一序列的中断，特别是 prolonged inflammation 或氧化应激，会损害组织修复并导致 chronic wounds。因此，选择合适的 wound dressings 对于调控伤口微环境和支持生理性愈合至关重要。
海藻酸钠基水凝胶因其亲水性、生物相容性以及维持湿润环境的能力而被广泛应用。当接触伤口渗出液时，海藻酸钠形成凝胶，保持水合作用，促进细胞活性，并在增殖期促进细胞粘附、增殖和成纤维细胞迁移。重要的是，海藻酸钠不干扰基质重塑，从而支持组织再生的自然进程。尽管有这些优点，海藻酸钠缺乏固有的生物活性，特别是在调节氧化应激方面。
活性氧（ROS）是早期伤口愈合中的关键信号分子，但其过度积累会损害细胞组分并延迟再生。因此，将抗氧化剂整合到伤口敷料中已成为一种有前景的策略，用以中和ROS、调节炎症和增强组织修复。已有研究探索了多种用于水凝胶基质的抗氧化系统，包括天然多酚（如单宁酸和儿茶素衍生物）、含儿茶酚的聚合物（如聚多巴胺、多巴胺功能化壳聚糖）和负载维生素E的制剂。然而，这些材料常存在强烈着色、光稳定性差、释放动力学控制有限以及氧化副产物潜在细胞毒性等缺点。
在此背景下，本研究采用柠檬烯衍生的低聚物——聚柠檬烯（PLM）作为一种新型、可持续且非挥发性的抗氧化添加剂。PLM通过R-(+)-柠檬烯（一种富含于柑橘皮废料中的可再生萜烯）的光诱导低聚反应合成，产生一种低分子量（约1 kDa）、富含烯丙基和共轭双键的低聚物。这些结构特征使其具有高效的自由基清除和氧化稳定能力，而其低聚物性质增强了与亲水聚合物的相容性，并防止了快速挥发或降解。PLM可以无缝整合到如AlgMA这样的可光交联水凝胶中，保持其机械和光学完整性。
与先前报道的抗氧化系统相比，PLM具有多个优势：它基于生物质并在温和、无金属条件下生产；其抗氧化效果可调，与其不饱和程度相关。然而，其可扩展性和组成重现性仍是未来转化研究中需要解决的挑战。尽管抗氧化功能化生物材料的数量日益增长，但尚无先前工作评估柠檬烯衍生低聚物的体内伤口愈合性能，或建立其抗氧化行为、结构特性和组织再生结果之间的机制关联。
本研究开发了一种含有3% (w/v) PLM的藻酸盐-甲基丙烯酰酯（AlgMA）基水凝胶，以评估其体内伤口愈合性能。选择该浓度是因为其在先前工作中显示出抗氧化能力、结构完整性和细胞相容性的最佳平衡。将该AlgMA/PLM3%配方与未修饰的AlgMA以及两种商业敷料（Sorbalgon和棉纱布）进行比较，使用啮齿动物切除性伤口模型进行评估。通过宏观成像评估伤口收缩，并使用数学模型进行定量描述，进一步通过组织学分析评估PLM的加入对愈合进程的影响。
2 材料与方法
2.1 化学品
海藻酸钠（Alg）、甲基丙烯酸酐（MA）、氢氧化钠（NaOH）购自Sigma-Aldldrich。Pluronic F127 三嵌段共聚物和光引发剂Irgacure I2959由BASF提供。R-(+)-柠檬烯（>93%）、N,N,N′,N″,N″-五甲基二亚乙基三胺（PMDETA）、N,N-二甲基乙酰胺（DMA）、二苯甲酮（BP）和2,2,2-三溴乙醇（TBE）购自Sigma-Aldrich。
2.2 含聚柠檬烯的海藻酸钠基水凝胶的合成
PLM的合成如前所述。将R-(+)-柠檬烯（LIM）与DMA按1:1体积比混合，加入催化剂PMDETA、三噁烷（TX）和TBE，摩尔比为100:5:1:1 (LIM:PMDETA:TX:TBE)。混合物在氮气氛围下脱氧，然后在40°C下用紫外光（365 nm, 2 mW cm?2）照射6小时。反应后产物经干燥去除未反应的LIM和DMA。通过1H NMR分析确定PLM的数均分子量（Mn）为964 Da。
AlgMA的合成如下：使用含有0.0103 mol/g聚合物羟基的2% (w/v)海藻酸钠溶液，滴加甲基丙烯酸酐（相对于羟基为4 M当量）。反应在25°C下进行24小时，pH维持在约8。反应后混合物稀释并透析（截留分子量12-14 kDa）3天，然后冻干。
水凝胶的制备：将PLM与Pluronic F127水溶液按1:1质量比混合，超声处理15分钟制备乳液。然后制备含3% PLM（相对于AlgMA重量）的5% (w/v) AlgMA溶液，得到AlgMA（对照）和AlgMA/PLM3%两种样品。溶液用氩气脱氧，加入Irgacure I2959（最终浓度为AlgMA甲基丙烯酸酯基团的4% mol/mol）。混合物浇铸在带有1 mm硅胶间隔物的玻璃板之间，并在UVA光（365 nm, 10 mW cm?2）下交联30分钟。
水凝胶的结构和形态表征在先前出版物中已详细描述，包括1H NMR、FTIR、HR-MAS NMR和SEM分析，证实了成功合成和适宜的微观结构。
2.3 体内伤口愈合评估
本研究经相关机构伦理委员会批准，并符合实验室动物实验伦理标准。实验使用成年雄性Wistar大鼠（6-8周龄，350-400 g）。动物在标准化条件下适应7天后，随机分为四组，评估AlgMA、AlgMA/PLM3%、无菌棉纱布（阴性对照）和Sorbalgon（商业海藻酸钠敷料，阳性对照）的效果。创建直径2 cm的切除性伤口，每3天更换一次敷料。在指定时间点拍摄伤口照片，并使用自定义Python脚本分析伤口面积、周长和圆形度。在第18天实施安乐死并进行组织学评估。
2.4 伤口面积收缩的数学模型
伤口收缩动力学通过将不同数学模型拟合到代表平均伤口面积随时间变化的实验数据来建模。考虑了五种模型：线性模型、Logistic模型、指数衰减模型、Gompertz模型和Weibull模型。所有模型的初始伤口面积（A0）固定为3.14 cm2。使用Python中SciPy库的curve_fit函数，通过Levenberg–Marquardt算法进行非线性回归来估计参数。根据决定系数（R2）和均方根误差（RMSE）为每个治疗组选择最佳拟合模型。
2.5 组织学
皮肤样品用10%缓冲福尔马林固定，石蜡包埋，切片厚度5 μm，用Masson三色法（苏木精-伊红-亚甲蓝）染色。使用光学显微镜分析并拍照。
2.6 统计学
定量数据以三次重复实验的平均值±标准差表示。使用单因素方差分析（one-way ANOVA）评估组间统计学差异，随后进行Tukey事后检验确定显著的 pairwise 差异（p < 0.05）。
3 结果与讨论
伤口愈合进程首先在四个治疗组（AlgMA、AlgMA/PLM3%、Sorbalgon和棉纱布）中进行定性评估。到第3天，所有伤口均表现出 intense redness 和 minimal contraction，这是炎症期的特征。值得注意的是，用AlgMA/PLM3%处理的伤口开始显示出炎症减轻的早期迹象。到第6天，这些伤口在边缘处也显示出 visible contraction，而棉纱布组的伤口 largely unchanged。在增殖期（第9-12天），AlgMA/PLM3%处理的动物表现出 accelerated healing， evidenced by smaller wound areas and drier surfaces。Sorbalgon和AlgMA处理支持 moderate healing，而棉纱布处理的伤口 continued to appear moist and inflamed。到第15天，用AlgMA/PLM3%处理的伤口显示出 near-complete closure and signs of re-epithelialization。在第18天，这些样品表现出最 advanced remodeling，伤口 fully closed，疤痕 minimal，优于其他组。
观察到的AlgMA/PLM3%处理 enhanced wound closure 可归因于PLM的 potent antioxidant activity，这可能抑制了伤口部位的氧化应激并促进了 overall tissue regeneration。相反，Sorbalgon和棉纱布 performance reduced 可能归因于其 clinical limitations。
同时，通过将伤口面积随时间减少的数据拟合到不同的数学模型（包括Logistic、Weibull、Exponential、Linear和Gompertz模型）来定量评估伤口愈合进程。Weibull模型提供了最佳的整体拟合。这些数学模型允许更深入地理解愈合动力学，并提供可与伤口闭合速率和模式相关联的参数。例如，在Logistic模型中，AlgMA/PLM3%处理表现出比AlgMA、Sorbalgon和棉纱布更高的速率参数（0.63 day?1）。数学上，这一结果表明AlgMA/PLM3%从愈合早期阶段就更有效地加速了伤口闭合。AlgMA/PLM3%的半最大愈合时间（t1/2）也短于其他组，反映了组织再生更快的 onset。在模型拟合方面，AlgMA/PLM3%优于AlgMA，并且比商业敷料具有更好的预测准确性。
被确定为伤口愈合数据最佳拟合的Weibull模型用于模拟愈合动力学。该分析进一步强调了AlgMA/PLM3%的优势，其表现出比AlgMA、Sorbalgon和棉纱布更高的形状参数，证实了更快速的愈合加速阶段。AlgMA/PLM3%的尺度参数略低于AlgMA，但显著高于Sorbalgon，表明其愈合轨迹更 sustained without early plateauing。棉纱布表现出最差的愈合动力学。在伤口愈合测定中的三个关键时间点，统计学分析 corroborated the trends predicted by the Logistic and Weibull models。到第6天，AlgMA/PLM3%组显示出的伤口面积显著小于其他处理。相比之下，单独使用AlgMA、Sorbalgon或棉纱布处理的伤口在它们之间没有显示出统计学显著差异。这种趋势持续到第12天和第18天，AlgMA/PLM3%始终是唯一与统计学上更小伤口面积相关的处理，证实了其在愈合全过程的 superior performance。
补充地，伤口圆形度（1.0代表完美圆形，指示对称愈合）的描述显示，所有处理开始时都接近1.0，并显示出 slight decline。AlgMA/PLM3%和AlgMA通常比Sorbalgon保持更好的圆形度，表明更 uniform wound contraction。然而，变异性随时间增加，可能是由于伤口闭合机制和生物变异性差异所致。伤口周长显示所有处理均 progressive decline。同样，AlgMA/PLM3%显示出更 steep decrease，支持其促进组织收缩的有效性。纱布和Sorbalgon处理的样品显示 slower reductions，与面积数据一致。
组织学分析提供了支持宏观观察到的 enhanced wound healing 的进一步证据，特别是在AlgMA/PLM3%组。在第6天，所有组均显示 incomplete re-epithelialization and an inflammatory infiltrate characteristic of the early inflammatory phase。然而，与其它处理相比，AlgMA/PLM3%组在伤口边缘显示出 denser granulation tissue and better organized cellular architecture。相反，Sorbalgon和棉纱布样品呈现 disorganized tissue with pronounced inflammatory infiltrates and minimal epithelial advancement。到第12天，所有组的组织再生更加明显，但程度不同。AlgMA/PLM3%组表现出更连续和更厚的 neoepidermis，以及早期真皮基质重塑和血管形成，表明向增殖期过渡。AlgMA和Sorbalgon显示出中度的上皮覆盖，但缺乏相同的真皮组织，而棉纱布处理的伤口仍然发炎，组织连续性明显中断，表皮层更薄。
到第18天，处理之间的差异变得更加明显。AlgMA/PLM3%组显示出几乎完全的皮肤再生，包括良好形成的表皮和更有序的真皮层，与正常组织非常相似。Sorbalgon也显示出愈合证据，但 epidermal stratification delayed and collagen deposition irregular。AlgMA处理的伤口显示真皮部分成熟，而棉纱布处理的组织继续表现出 incomplete remodeling 的迹象，包括残留的炎症细胞和 disorganized epidermal layers。总之，这些组织学发现 corroborate the superior wound contraction and healing kinetics observed in the AlgMA/PLM3% group，支持了加入3% PLM不仅加速闭合而且促进更有序的组织再生的观点。
AlgMA/PLM3%水凝胶 superior regenerative performance 可与其在先前研究中描述的结构和机械特性直接相关。该水凝胶表现出约3–4 kPa的储能模量，接近90%的凝胶分数和接近1500%的溶胀度，表明其具有确保结构完整性和高渗出液吸收能力的优化交联密度。互连的多孔网络有利于细胞迁移、血管长入以及有效的氧气和营养扩散。这些特征创造了一个机械顺应 yet supportive 的环境，再现了真皮组织的粘弹性微观结构。结合PLM的 controlled release（减轻了氧化应激和炎症），这种结构特征解释了体内观察到的 accelerated epithelialization, improved collagen organization, and reduced scar formation。总之，这些发现强调，增强的愈合反应源于AlgMA基质优化的机械/形态学设计与PLM的生物活性抗氧化功能之间的协同相互作用。
4 结论
结合定性、定量和组织学分析表明，将3% PLM加入AlgMA水凝胶基质中，与纯AlgMA和商业敷料相比，显著增强了伤口愈合结果。AlgMA/PLM3%促进了炎症的早期消退、更快的伤口收缩和更完整的组织再生，这体现在更小的伤口面积、改善的伤口几何形状和 superior re-epithelialization。Weibull模型为伤口面积数据提供了最佳拟合，定量确认了与该配方相关的加速和持续愈合。组织学发现进一步证实了这些观察结果，揭示了AlgMA/PLM3%组中更有序的真皮结构和 advanced remodeling。增强的愈合性能归因于PLM的抗氧化活性，其在愈合过程的所有阶段调节了氧化应激并支持了组织再生。这些结果 reinforce the potential of AlgMA/PLM3% as a promising bioactive dressing for improved wound management。
