《RSC Advances》：Development of substituted 2-(4-(sulfonyl)piperazin-1-yl)quinazoline molecular hybrids as a new class of antimalarials
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本文针对疟原虫对青蒿素联合疗法（ACTs）的耐药性问题，设计并合成了一系列基于喹唑啉-磺酰胺杂合体的新型抗疟化合物。研究通过分子杂交策略，将喹唑啉骨架与四氢呋喃甲基胺或三氟甲基三唑并哌嗪等活性片段结合，显著增强了对氯喹敏感型Pf3D7疟原虫的抑制活性（IC50低至2.9 μM）。细胞毒性实验表明化合物选择性高，计算机模拟提示其作用机制可能与抑制疟原虫半胱氨酸蛋白酶（PfFP2/PfFP3）和锌金属蛋白酶（PfFLN）相关。该研究为开发多靶点抗疟药物提供了新思路。
疟疾是一种由疟原虫引起的、威胁人类健康的全球性传染病。尽管青蒿素联合疗法（ACTs）在临床上广泛应用，但疟原虫对现有药物耐药性的快速出现，使得疟疾的防治面临严峻挑战。仅2023年，全球因疟疾导致的死亡人数就高达59.7万，较前三年上升了10%。研发具有新颖作用机制、能有效对抗耐药疟原虫的新型抗疟药物，已成为全球公共卫生领域的迫切需求。
在这一背景下，喹唑啉类化合物因其广泛的生物活性（包括抗疟、抗菌、抗病毒等）而受到关注。研究表明，喹唑啉骨架的2位和4位取代基对其抗疟活性至关重要。此外，磺酰胺基团、四氢呋喃甲基胺以及三氟甲基三唑并哌嗪等结构单元，也分别在抗感染、抗癌等领域展现出良好的药理潜力。受到这些发现的启发，研究人员设想：能否通过分子杂交策略，将上述多个具有生物活性的药效团整合到同一个分子中，从而开发出具有多靶点作用机制的新型抗疟药物？
为了回答这个问题，研究团队设计并合成了一系列全新的2-(4-(磺酰基)哌嗪-1-基)喹唑啉分子杂合体。他们的核心策略是以喹唑啉为核心骨架，在其4位引入四氢呋喃甲基胺或3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪，同时在2位通过哌嗪连接各种取代的苯磺酰胺基团，旨在构建具有协同多药理学效应的三功能杂合分子。
本研究主要运用了多步有机合成、核磁共振波谱（NMR）和高分辨质谱（HRMS）进行化合物结构确证；通过SYBR Green染料法测定化合物对恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）氯喹敏感株Pf3D7的体外抑制活性（IC50）；采用MTT法评估化合物对哺乳动物肺腺癌A549细胞和由THP1单核细胞分化而来的巨噬细胞的细胞毒性；并综合利用计算机模拟技术，包括分子对接、分子动力学（MD）模拟和分子力学/广义波恩模型表面积（MM-GBSA）计算，预测化合物的潜在作用靶点和结合模式。
2.1. 化学合成
研究人员通过多步反应成功合成了目标喹唑啉-磺酰胺杂合体。关键中间体2,4-二氯喹唑啉（11）由邻氨基苯甲酸甲酯与尿素反应后经三氯氧磷氯化制得。该中间体随后分别与四氢呋喃甲基胺或3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪反应，得到4位取代的中间体12和14。这些中间体进一步与哌嗪或吗啉反应，生成带有游离哌嗪的中间体15和17。最后，这些中间体与各种取代的磺酰氯反应，得到最终的目标化合物19a-19t。所有最终产物和关键中间体的结构均通过1H NMR、13C NMR和HRMS进行了充分表征。
2.2. 化合物的抗疟活性研究
抗疟活性测试结果显示，大多数合成的杂合分子对药物敏感的Pf3D7疟原虫株表现出显著的抑制活性，IC50值低于10 μM。其中，四个化合物（19b, 19c, 19h, 19r）的活性尤为突出，IC50值低于5 μM。化合物19r（在喹唑啉4位连接三唑并哌嗪，2位连接2-硝基苯磺酰胺）活性最强，IC50为2.9 μM。化合物19c（在喹唑啉4位连接四氢呋喃甲基胺，2位连接4-乙酰氨基-3-氯苯磺酰胺）也表现出高效力，IC50为3.4 μM。构效关系（SAR）分析表明，喹唑啉4位的取代基（三唑并哌嗪优于四氢呋喃甲基胺）以及磺酰胺苯环上取代基的性质和位置（吸电子基团如氯、硝基通常有利于活性）对抗疟效力有显著影响。
2.3. 化合物对寄生虫发育和形态的影响
为了解化合物的作用模式，研究人员选取活性最好的几个化合物，观察它们对疟原虫不同无性血液阶段发育和形态的影响。结果发现，与溶剂对照组（DMSO）相比，经化合物处理的寄生虫其发育进程受到显著抑制。值得注意的是，在处理过的寄生虫中未观察到疟色素（hemozoin）晶体的形成，这提示化合物可能通过干扰寄生虫的血红蛋白消化途径或血红素解毒途径（例如抑制疟色素的形成）来发挥抗疟作用。具体而言，化合物19c能抑制滋养体向裂殖体的转化，导致裂殖体阶段发育停滞，并伴随食物泡肿胀。而化合物19b, 19h, 19r则主要引起寄生虫在红细胞内收缩，并停滞在环状体阶段。化合物19q和19r则导致寄生虫停滞在滋养体阶段，并伴有食物泡的明显肿胀。食物泡的肿胀现象与天冬氨酸蛋白酶或半胱氨酸蛋白酶抑制剂的报道相似，暗示这些化合物可能通过抑制这些蛋白酶来发挥作用。
2.4. 化合物的细胞毒性
细胞毒性评估显示，所测试的活性化合物对哺乳动物细胞的毒性较低，表明其抗疟活性具有选择性。特别是活性最好的化合物19r，对A549细胞的IC50为193.5 μM，其抗疟选择性指数（SI = 细胞毒性IC50/ 抗疟IC50）高达66.72，显示出良好的安全性窗口。同样，在100 μM和500 μM的高浓度下，化合物对由THP1单核细胞活化而来的巨噬细胞生长抑制率均小于20%，进一步证实了其较低的细胞毒性。这些结果共同表明，化合物的抗疟活性是特异性的，并非由一般性细胞毒性引起。
2.5. 计算机模拟研究
2.5.1. 分子对接研究
为了预测化合物的潜在作用靶点，研究人员将活性分子与疟原虫食物泡中多个已知的靶点蛋白（如半胱氨酸蛋白酶PfFP2、PfFP3，天冬氨酸蛋白酶Plasmepsins I, II, IV, IX, X，组氨酸天冬氨酸蛋白酶HAP，锌金属蛋白酶Falcilysin PfFLN，以及血红素解毒蛋白HDP）进行了分子对接。通过比较对接打分与实验测得的IC50值之间的决定系数（R-squared），发现化合物与PfFP2、PfFP3和PfFLN的结合亲和力与抗疟活性具有较好的相关性（R2 ≥ 0.7）。蛋白-配体相互作用分析显示，活性化合物（如19c和19r）能够与这些靶点蛋白的活性口袋形成多个氢键、疏水相互作用、π-π堆积甚至盐桥等关键相互作用，从而稳定地结合在靶点蛋白上。
2.5.2. 分子动力学模拟与MM-GBSA分析
为进一步验证结合稳定性，研究人员对对接得到的蛋白-配体复合物进行了200纳秒的分子动力学模拟。均方根偏差（RMSD）和均方根涨落（RMSF）分析表明，化合物19c和19r与PfFP2、PfFP3，特别是与PfFLN形成的复合物在整个模拟过程中结构稳定，配体在结合口袋中的构象波动较小。蛋白质-配体接触分析进一步揭示，在模拟过程中，配体与靶蛋白的关键氨基酸残基（如PfFLN的ASN420、ASN421和PHE529）之间能持续维持稳定的相互作用。基于分子动力学轨迹的MM-GBSA结合自由能计算结果显示，化合物与PfFLN的结合自由能最优（ΔG约-50至-51 kcal mol-1），且计算值的标准偏差最小，表明结合最为稳定。这些计算数据共同提示，PfFLN可能是这类喹唑啉-磺酰胺杂合体的一个主要作用靶点，同时可能伴随对PfFP2和PfFP3的抑制。
3. 结论
本研究成功通过分子杂交策略，设计并合成了一系列结构新颖的2-(4-(磺酰基)哌嗪-1-基)喹唑啉杂合体，并系统评价了其抗疟活性。研究发现，多个化合物对氯喹敏感的Pf3D7疟原虫株表现出微摩尔级别的抑制活性，其中化合物19r和19c活性最佳。重要的是，这些活性化合物对哺乳动物细胞毒性低，选择性高。计算机模拟研究（分子对接、分子动力学和MM-GBSA）强有力地预测，这类化合物的抗疟作用机制可能涉及同时抑制疟原虫的多个关键蛋白酶，尤其是锌金属蛋白酶PfFLN，以及半胱氨酸蛋白酶PfFP2和PfFP3。这种多靶点作用机制有助于克服现有药物的耐药性问题。此外，化合物的预测ADME（吸收、分布、代谢、排泄）性质符合类药性要求。综上所述，该研究不仅发现了一类具有开发前景的新型抗疟先导化合物（特别是19r和19c），凸显了分子杂交策略在抗疟药物研发中的价值，也为后续基于这些先导化合物进行结构优化和深入的机制研究奠定了坚实的基础。本研究发表于《RSC Advances》期刊。
