哌啶催化合成(E)-2-氰基丙烯酰胺：晶体结构、抗增殖活性及分子对接研究

《RSC Advances》：Piperidine-catalyzed synthesis of ( E)-2-cyanoacrylamides: crystallographic, antiproliferative, and docking studies

本文报道了一种在温和环保条件下，以哌啶为催化剂，通过(杂)芳香醛与2-氰基乙酰胺的Knoevenagel缩合反应高效合成(E)-2-氰ano-3-(杂)芳基丙烯酰胺类化合物的新方法。该研究系统评价了目标化合物的抗增殖活性，发现多个化合物对多种人源癌细胞系表现出优异的选择性抑制活性，其效力与参考药物奥希替尼相当甚至更优。分子对接研究揭示了化合物与表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶结构域的有效结合，为基于α-氰基丙烯酰胺骨架开发新型抗癌先导化合物提供了重要依据。

　　

在抗癌药物研发领域，靶向共价抑制剂（TCIs）已成为一种核心策略。这类抑制剂通过其反应性弹头与靶蛋白特定氨基酸残基（如半胱氨酸）形成可逆或不可逆共价键，从而提供更强的效力和选择性、更长的作用持续时间以及更低的耐药风险。自2001年以来，美国FDA已批准了45种与靶蛋白形成不可逆共价键的药物，其中包含11种用于癌症治疗的酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）。值得注意的是，这些抑制剂中有10种以丙烯酰胺作为弹头，通过迈克尔加成反应与靶酶形成共价键。然而，传统的α-未取代丙烯酰胺虽然能增强抑制剂活性并克服耐药性，但也存在严重的脱靶效应和不可逆抑制等风险。相比之下，α-氰基丙烯酰胺具有反应性降低、可与半胱氨酸形成可逆共价键等显著优势，从而提高了靶点选择性并最大限度地减少了不良反应。因此，开发高效、绿色合成α-氰基丙烯酰胺类化合物的方法，并深入研究其生物活性，对于抗癌药物发现具有重要意义。

传统上，α-氰基丙烯酰胺的合成通常涉及醛与2-氰基乙酰胺在布朗斯特碱存在下的Knoevenagel缩合反应。尽管均相和非均相催化策略已被开发用于改进该转化，但现有方法仍存在使用危险催化剂或溶剂、催化剂制备复杂、催化剂负载量高以及纯化过程繁琐等局限性，限制了其可扩展性和可持续性。

发表在《RSC Advances》上的这项研究，成功克服了这些局限性。研究人员开发了一种水促进的、哌啶催化的Knoevenagel缩合方法，用于在室温下由(杂)芳香醛和2-氰基乙酰胺合成α-氰基丙烯酰胺。随后，通过体外抗癌实验和分子对接研究，证明了这些化合物在药物化学中作为有前景的EGFR抑制剂的潜力。

为开展本研究，作者主要运用了以下关键技术方法：首先，他们优化了以哌啶为催化剂、水为溶剂的Knoevenagel缩合反应条件，合成了系列(E)-2-氰基-3-(杂)芳基丙烯酰胺衍生物，并通过单晶X射线衍射确认了关键化合物的(E)-构型。其次，利用美国国家癌症研究所（NCI）的NCI-60人源癌细胞系平台，通过磺酰罗丹明B（SRB）法系统评估了所有化合物的体外抗增殖活性，并计算了GI₅₀（半数生长抑制浓度）和LC₅₀（半数致死浓度）值。此外，采用ADMETlab 3.0进行了Tox21通路分析，以预测化合物的毒性机制。最后，运用分子对接技术（AutoDock Vina）将活性化合物与表皮生长因子受体（EGFR）的酪氨酸激酶结构域（PDB ID: 1M17）进行对接，以阐明其潜在的结合模式和作用机制。

2. 结果与讨论

2.1. 化学合成

研究人员首先以4-氯苯甲醛和2-氰基乙酰胺为模型反应，对Knoevenagel反应条件进行了优化。最终确定的最佳条件为：使用10 mol%的哌啶作为催化剂，水作为溶剂，在室温下反应6小时，能以93%的收率得到目标产物。该方法条件温和、操作简单、使用绿色溶剂，并且纯化过程简便（多数情况下仅需过滤洗涤）。在最优条件下，该策略成功应用于一系列含有吸电子或给电子取代基的(杂)芳香醛，以40-95%的收率合成了15种(E)-2-氰基-3-(杂)芳基丙烯酰胺类化合物（3a-3o）。所有产物的(E)-构型均通过单晶X射线衍射分析得到明确确认。该合成方法还成功扩展到其他活泼亚甲基化合物，如丙二酰胺和氰基乙酸乙酯，以中等至良好的收率得到了相应的Knoevenagel加成物。

2.3. X射线晶体学研宄

对化合物3k（(E)-3-(9-蒽基)-2-氰基丙烯酰胺）进行了单晶X射线衍射分析。晶体结构显示分子呈近乎平面构象。静电势（ESP）映射表明，羰基/氰基区域电负性最强，而羟基/氨基区域电正性最强。分子通过O-H?O、N-H?N和N-H?O氢键作用形成分子层，这些层又通过π?π堆积作用和范德华力进一步连接，最终形成层状超分子结构。

2.4. 物理化学和类药性分析

对合成的Knoevenagel加成物进行了类药五规则（Lipinski's Rule of Five）分析。所有化合物的分子量、氢键供体/受体数均符合规则。除化合物3o（log P = 6.12）外，其他化合物的脂水分配系数（log P）均小于5。所有化合物的拓扑极性表面积（TPSA）在53.34 ?2到112.71 ?2之间，预测吸收百分比（%ABS）在70.12%到90.60%之间，表明这些化合物具有较好的膜渗透性。此外，还分析了化合物的sp3碳原子分数（Fsp3），所有值均较低（≤0.17），这与它们主要是不饱和分子骨架的特点一致。

2.5. 抗增殖活性

通过美国国家癌症研究所（NCI）的NCI-60人癌细胞系 panel，对合成的Knoevenagel加成物进行了体外抗增殖活性评价。在10 μM单剂量初筛中，化合物3f、3n和3o表现出最强的活性，平均生长抑制率（Mean %G）分别为40.97、-63.43和36.80。随后对这3个活性最好的化合物进行了五剂量（0.01 - 100 μM）测试。

结果显示，化合物3f（带有-CONH?）和3o（带有-COOEt）对多种癌细胞系表现出强效和选择性的抗增殖活性，其GI₅₀值在0.287 μM 到 1.94 μM之间，并且LC₅₀/GI₅₀比值均大于等于100，表明是选择性生长抑制而非非特异性细胞毒性。尤其值得注意的是，化合物3f和3o对CAKI-1肾癌细胞系的活性最强，GI₅₀值分别为0.287 μM和0.336 μM，与参考药奥希替尼（Osimertinib, GI₅₀= 0.343 μM）效力相当。此外，化合物3f和3o对HCT-116结肠癌细胞系的活性也优于奥希替尼。相比之下，化合物3n（含有两个-CONH?基团且缺少氰基）虽然也显示出较强的生长抑制活性，但其GI₅₀与LC₅₀值接近，表明其活性可能部分源于非特异性细胞毒性作用，但其对某些血液癌细胞系仍表现出选择性活性。结构-活性关系（SAR）分析表明，在α,β-不饱和羰基骨架中引入R1 = NPh?取代基（如3f, 3n, 3o）能显著增强抗增殖活性；并且R3 = CONH?（3f）的活性优于相应的R3 = CN类似物（3o）。

2.6. 机制毒理学分析

为了解化合物非特异性细胞毒性的潜在机制，利用ADMETlab 3.0进行了Tox21通路分析。结果表明，化合物3f、3n和3n均对Nrf2介导的氧化应激通路（SR-ARE）有中度激活作用。此外，化合物3n还对雄激素受体结合（NR-AR-LBD）和p53依赖性DNA损伤反应（SR-p53）通路显示出中度活性。这些发现表明，3n的细胞毒性可能源于氧化应激、激素信号和凋亡机制的综合作用。

2.7. 分子对接研究

为了阐明活性化合物的潜在作用机制，研究人员选择表皮生长因子受体（EGFR）的酪氨酸激酶结构域（PDB ID: 1M17）作为靶点，对化合物3f、3n和3o进行了分子对接研究。对接结果显示，这三个化合物都能有效地结合在EGFR的活性口袋中，其结合自由能（-7.8 至 -8.7 kcal mol?1）均优于参考配体厄洛替尼（Erlotinib, -6.6 kcal mol?1）。化合物3f通过其丙烯酰胺部分与Met769和Pro770形成氢键，其芳环部分与Val702、Leu820等残基发生疏水相互作用，并与Lys721、Asp831等发生π-阳离子/π-阴离子相互作用。化合物3n和3o的结合模式与3f相似，但也有一些独特的相互作用，例如化合物3o还与关键的Cys773残基有相互作用，该残基在EGFR催化结构域的配体识别和结合中起着关键作用。这些对接结果从理论上支持了这些化合物作为EGFR抑制剂的潜力，为其抗增殖活性提供了分子层面的解释。

3. 结论

本研究成功开发了一种高效、绿色的哌啶催化合成(E)-2-氰基-3-(杂)芳基丙烯酰胺类化合物的方法。体外抗增殖活性筛选发现，多个化合物，特别是含有N,N-二苯氨基的衍生物（3f, 3n, 3o），对NCI-60 panel中的多种人癌细胞系表现出强效且选择性的生长抑制活性，其效力与参考药物奥希替尼相当甚至更优。机制研究表明，活性化合物的作用可能与抑制EGFR酪氨酸激酶活性有关。该研究不仅提供了一种合成α-氰基丙烯酰胺类化合物的实用方法，而且发现了一类具有开发前景的抗癌先导化合物，为基于α-氰基丙烯酰胺骨架的新型靶向抗癌药物的合理设计提供了重要的结构基础和理论依据。