《Nature Plants》：Carotenoid biosynthesis drives root plasticity through aerenchyma and iron plaque formation in rice
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本研究揭示了水稻八氢番茄红素合酶2（OsPSY2）通过协调脱落酸（ABA）和独脚金内酯（SLs）的类胡萝卜素衍生生物合成，分别独立调控铁膜沉积和通气组织发育，从而阐明水稻根系适应水涝胁迫的新机制。该发现修正了当前对通气组织与铁膜形成关系的认知，为作物抗逆育种提供了重要靶点。
Abstract
水稻根系通过形成通气组织实现从地上部向根部的氧气输送，从而适应水淹环境。根系输送的氧气将亚铁离子（Fe2+）氧化为铁化合物，形成铁膜以缓解铁毒害。然而，连接通气组织与铁膜形成的分子机制尚不明确。本研究鉴定出一个同时缺陷于通气组织和铁膜形成的水稻突变体AZ1302，其致病突变定位于PHYTOENE SYNTHASE 2（OsPSY2）基因。CRISPR–Cas9诱导的psy2突变体根部类胡萝卜素衍生激素独脚金内酯和脱落酸水平降低。外源施加独脚金内酯可挽救psy2突变体的通气组织形成，而脱落酸能恢复铁膜沉积，证明这两种激素在调控两个过程中具有独立功能。这些发现通过解析通气组织与铁膜形成的角色，修正了现有认知，确立了OsPSY2在整合激素信号驱动根系可塑性中的作用，为植物在环境胁迫下的适应机制提供了新见解。
Main
水稻作为维持全球过半人口的主粮作物，其生长和产量对环境波动高度敏感。根系可塑性——即根系响应胁迫调整自身构型的能力——对适应营养失衡和水份极端条件至关重要。水稻根系通过形成通气组织和铁膜沉积两种关键机制适应环境胁迫。解析其分子机制可为提升水稻抗逆性提供新策略。
水淹条件下多数植物因缺氧和矿物毒害难以生存，但水稻进化出特异的根系适应机制。通气组织是根系中的通道状结构，促进氧气从地上部向根部传输，赋予其耐缺氧能力。另一关键适应是根表亚铁离子（Fe2+）氧化形成红棕色铁膜，其通过螯合过量Fe2+保护根系免受铁毒害，并调控养分有效性及土壤微生物互作。这些观察暗示通气组织与铁膜沉积存在功能关联，因通气组织增强根部氧气输送，为铁膜形成的氧化过程所必需。然而，通气组织在铁膜形成中的具体作用仍属推测且知之甚少。
通气组织形成是水稻根系的固有特征，但可被水淹、缺氧/乙烯及生长素信号等多种环境与生理因素增强。乙烯激活呼吸爆发氧化酶同源物H（RBOH），在皮层细胞产生活性氧（ROS）。当ROS水平超过金属硫蛋白清除能力时，皮层细胞发生程序性死亡，形成气腔构成通气组织。通过通气组织输送至根表的氧气在Fe2+氧化为Fe3+中起关键作用，驱动铁膜形成。然而，尽管对通气组织形成研究广泛，其直接参与铁膜沉积的机制尚未验证。
为此，本研究以籼稻品种IR64的化学诱变群体为材料，通过遗传定位鉴定出PHYTOENE SYNTHASE 2（OsPSY2）为调控通气组织与铁膜形成的关键基因。研究证明OsPSY2调控独脚金内酯和脱落酸的生物合成，二者分别正调控通气组织形成和铁膜沉积。结果凸显了这两种性状的独立调控机制，为水稻适应水淹条件和缓解铁毒害提供了关键见解。
Results
A locus on chromosome 12 governs aerenchyma and iron plaque
低地栽培条件下水稻根系形成铁膜，而高地条件下显著减少。为阐明铁膜形成的遗传机制，我们在高铁条件下筛选IR64品种的叠氮化钠（NaN3）诱变群体。根据表型观察，突变体‘413’、‘419’、‘654’和AZ1302在不定根中铁膜形成减少。相反，野生型和突变体的种子根均未检测到明显铁膜。其中AZ1302突变体还表现出径向氧损失（ROL）和通气组织形成缺陷，需深入遗传解析。与保持正常通气组织、ROL和铁膜形成的IR64相比，AZ1302证实存在发育和生理紊乱。该突变体未表现主要地上部生长或发育异常，包括分蘖能力。
为定位AZ1302铁膜缺陷表型的位点，将其与遗传距离较远的粳稻品种日本晴正反交。F1代在铁膜形成和通气组织形成上均表现野生型表型。F2群体分离符合野生型与突变体3:1比例，表明AZ1302突变表型受单隐性基因控制。F2群体数量性状基因座（QTL）分析鉴定出染色体12上一个与抑制通气组织和铁膜形成相关的QTL。LOD图谱将候选基因定位至染色体12上标记AX-123173361（26.68 Mb）和AX-123173380（27.16 Mb）间471 kb区间。序列分析发现该区间内存在33个预测开放阅读框（ORF1–ORF33）。
A mutation in OsPSY2disrupts aerenchyma and iron plaque formation
定位区间预测ORFs序列比对发现AZ1302突变体相对于野生型IR64存在一个功能突变。在OsPSY2（Os12g0626400）第二外显子与内含子间的剪接供体位点检测到C-to-T单核苷酸多态性（SNP），可能导致剪接变异。设计特异性引物检测正常剪接、内含子保留和外显子跳跃。在IR64中仅观察到正常剪接，而AZ1302突变体显示不同剪接变体：除正常剪接外，存在第二内含子保留和第二外显子跳跃两种异常剪接。内含子保留引入提前终止密码子，外显子跳跃导致OsPSY2蛋白截短。
OsPSY2编码八氢番茄红素合酶，是类胡萝卜素合成途径的关键酶。为探究类胡萝卜素合成与通气组织和铁膜形成的潜在联系，我们检测了类胡萝卜素合成抑制剂的影响。用氟啶酮（norflurazon）和敌草隆（dichlormate）处理IR64后评估表型。抑制剂导致通气组织和铁膜形成减少，进一步支持类胡萝卜素在调控这些表型中的作用。结果强烈提示OsPSY2是通气组织和铁膜形成表型的候选基因，促使我们进行功能验证研究。
为确认OsPSY2在通气组织和铁膜形成中的调控功能，利用CRISPR-Cas9技术在Kitaake背景中生成psy2突变体。使用四个靶向第一外显子（两个向导）、第一内含子和第五外显子的单导向RNA创建了三个独立的OsPSY2敲除系。三个系均预测编码截短蛋白（分别为130、319和137个氨基酸）。psy2突变体地上部未表现明显生长或发育影响。在水培条件下，psy2突变体在两周龄和三周龄阶段不定根通气组织显著减少，铁膜形成减少，根际铁膜提取物显示铁和锰含量降低。与野生型根表形成额外铁膜层不同，psy2突变体铁膜形成减少，通过激光剥蚀电感耦合等离子体质谱（LA-ICP-MS）分析根横截面证实。psy2突变体与AZ1302突变体表型相似，提示OsPSY2是AZ1302突变体通气组织和铁膜形成缺陷的致病基因。
除通气组织和铁膜外，对照条件下psy2突变体除ROL降低外无其他明显表型。然而，高铁条件下psy2突变体根长减少、根干重增加。根数、侧根密度、茎长和茎干重无变化。此外，psy2突变体叶绿素含量降低。根、茎和糙米中铁含量未受影响。在AZ1302类似重组自交系中过表达OsPSY2恢复了铁膜和通气组织形成，进一步确认OsPSY2为这些过程的关键调控因子。PSY2过表达显著增加根长、根数和茎长，而侧根密度不变。提示OsPSY2正调控不定根生长、根数和茎伸长，但不调控侧根形成。
OsPSY2is expressed in young adventitious roots
为分析OsPSY2表达模式，用OsPSY2启动子驱动的GUS报告载体转化Kitaake。X-Gluc染色显示GUS活性在年轻不定根中，这些根是区分野生型与突变体通气组织和铁膜形成的主要部位。染色根横截面分析显示OsPSY2启动子驱动的GUS主要在维管组织表达。提示不定根中OsPSY2表达对调控通气组织和铁膜发育至关重要。此外，GUS活性在地上部（主要为叶鞘）较高。与根类似，OsPSY2在维管组织高表达。GUS活性显示在穗和颖花中表达。该表达模式表明PSY2介导的类胡萝卜素合成可能影响水稻生理和发育过程。
OsPSY2mutation disrupts carotenoid biosynthesis, affecting SLs and ABA
为揭示OsPSY2调控通气组织和铁膜形成的分子机制，我们量化了Kitaake和psy2突变体中的类胡萝卜素及其衍生植物激素。超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF-MS）表明psy2突变体根中八氢番茄红素和β-胡萝卜素水平显著低于野生型。
独脚金内酯和脱落酸是类胡萝卜素合成途径下游合成的关键激素。在psy2突变体中，该途径限速步骤的破坏导致ABA和SL水平显著降低。对照和高铁条件下psy2突变体根中ABA含量持续低于野生型。类似地，psy2突变体根中独脚金内酯如4-脱氧独脚金醇（4DO）和4-氧代-甲基胡萝卜内酯酸（4-oxo-MeCLA）显著减少，且与玉米素（zaxinone）含量无关，玉米素是水稻内源负调控SL生物合成的类胡萝卜素裂解产物。突变体根系分泌物中多种SL水平也降低，包括氧化胡萝卜内酯、4-氧代-19-OH-CL、4-oxo-MeCLA、4DO和独脚金醇。SL分泌减少显著降低独角金种子发芽率，提示OsPSY2可作为降低水稻对独角金感病性的潜在靶点。这些结果凸显了PSY2介导的类胡萝卜素合成在维持水稻根系发育和功能所需激素谱中的关键作用。
SL and ABA regulate aerenchyma and iron plaque, respectively
为鉴定调控通气组织和铁膜形成的激素，在水培条件下向野生型和突变体外源提供合成SL GR24和ABA。ABA处理增强Kitaake铁膜形成，并恢复psy2突变体铁膜形成；而GR24不影响psy2突变体铁膜形成。ABA处理不影响通气组织形成，而外消旋GR24和(+)-GR24均在psy2突变体两周龄和三周龄阶段恢复通气组织形成。
此外，GR24和ABA对根系发育有相反效应。GR24处理导致根干重和茎长减少，而根长受影响不同：野生型增加，突变体减少。ABA促进根毛伸长，但对根毛密度影响各异：野生型根毛密度降低，突变体增加。这些发现证明SLs特异性调控通气组织形成，而ABA特异性调控铁膜形成，二者均位于类胡萝卜素合成途径下游。
SL和ABA途径的遗传和化学破坏显著改变根中通气组织和铁膜形成。SL生物合成途径突变体d17和d10及SL信号突变体d14根长较短。相同长度根距离根尖2–3 cm和4–5 cm处通气组织形成显著减少，但铁膜形成未受抑制。该表型进一步支持SLs在通气组织形成中的关键作用。ABA信号抑制剂ABA Antagonist1（AA1）处理优先影响Kitaake铁膜沉积，进一步证明ABA在铁膜沉积中的必需角色。
Discussion
通气组织已知为水稻根系铁膜形成的关键调控因子，二者均被高铁诱导。然而，我们的发现表明根中通气组织对铁膜形成既非必需也非充分。其他具有正常通气组织但铁膜形成受损的NaN3诱导突变体进一步支持此结论。此外，本研究提供了对水稻通气组织和铁膜形成独立激素调控机制的关键理解，揭示了SLs和ABA作为类胡萝卜素生物合成下游效应子的角色。激素调控特异性明显，因GR24不影响铁膜形成，ABA不影响psy2突变体通气组织形成。而且，SL生物合成和信号突变体中通气组织减少从遗传上确认了SLs在通气组织形成中的作用。
PSY参与类胡萝卜素合成途径第一步。编码八氢番茄红素合酶的基因突变表现与后续步骤突变类似效应，如类胡萝卜素、SLs和ABA含量降低。与其他步骤突变不同，三个OsPSYs存在表达和调控模式变异，防止了psy2突变体出现严重生长和发育影响如矮化和高分蘖。OsPSY2可能以组织特异性方式作用，且节和地上部SL水平未测量，故psy2突变体中局部生物合成可能未受影响。SLs和通气组织在psy2中减少程度更大，可能由于磷饥饿处理和专门评估不定根。OsPSY2对根毛生长的多效调控及ABA在psy2突变体中的恢复提示浓密根毛参与氧化Fe2+形成铁膜。
尽管我们的结果提供重要见解，但SL和ABA生物合成在多个步骤受调控。未来对直接调控SLs或ABA的基因研究旨在提供所涉特定基因及其可能互作的更全面见解。评估ABA生物合成和信号突变体中铁膜形成将进一步确认ABA作用及铁膜独立调控。本研究揭示了OsPSY2在协调通气组织形成和铁膜沉积中的特定作用，但水稻基因组编码多个PSY同源物。它们对根系可塑性和胁迫适应的潜在贡献大多未探索。未来对PSY旁系同源物功能冗余或分化研究可提供水稻如何响应环境线索微调类胡萝卜素衍生激素生物合成的更深见解。此类研究可能揭示增强植物对波动土壤条件适应性的新调控模块。
此外，对其他具有正常通气组织形成的NaN3诱导铁膜突变体研究将提供更广泛详细机制见解。除根际信号外，已知SLs与包括乙烯在内的其他激素途径互作，乙烯是诱导性通气组织的已知调控因子。SLs和ABA效应可能通过与其他激素信号途径互作介导，在根系发育中起关键作用。进一步研究应探索这些调控机制是否独立或协调运作以控制水稻不定根中固有和诱导性通气组织形成。
通气组织形成增强对淹水和干旱胁迫耐受性，而铁膜通过吸附砷、镉、铬、铅、硒和硅等元素构成屏障。尽管铁膜响应毒性铁形成，但其通过有机酸介导溶解作为铁库，并作为稻田重要碳汇。总之，理解这些根系性状的分子和激素调控为增强水稻及其他作物抗逆性和优化养分管理提供新机遇。我们的发现突出为农艺效益改良根系性状及评估其他物种（特别是在淹水和铁毒土壤中）调控途径保守性的策略。
