《Molecules》：Unveiling Fermentation Effects on the Functional Composition of Taiwanese Native Teas
Abstract
茶化学成分受品种、采收成熟度和生长环境影响，但加工仍是决定最终品质的主导因素。尽管台湾本土茶种类多样，但针对多个制造阶段功能成分的系统比较仍有限。本研究评估九种代表性台湾茶在四个关键加工阶段——绿茶（G）、酶促发酵（氧化发酵，F）、烘焙前半成品茶（S）和成品茶（C）——以阐明酶促氧化、揉捻和烘焙如何改变主要生物活性成分。绿茶阶段样品表现出明显的品种依赖性特征：大叶品种含有较高的儿茶素和没食子酸，而以芽为主的小叶茶则显示较高的咖啡因和氨基酸，且氨基酸在较高海拔进一步增加。发酵强度主导主要化学转变，包括儿茶素消耗、没食子酸形成、早期儿茶素衍生的配对氧化聚合化合物（POPCs）积累，以及在重度发酵茶中茶黄素的显著增加。L-茶氨酸在经历长时间萎凋的茶中下降最明显。烘焙进一步减少氨基酸但对咖啡因影响最小，而揉捻效果因茶类型而异。总体而言，本研究提供了台湾本土茶首个阶段解析的化学图谱，为优化加工策略以增强功能性植物化学物质 profiles 提供实用见解。
1. Introduction
茶是全球消费最广泛的饮料之一，含有多种生物活性成分，包括儿茶素、没食子酸（GA）、黄酮醇、氨基酸、咖啡因和挥发性化合物。茶的化学特征受品种、采收季节、农艺管理、气候、土壤特性和采摘成熟度等诸多因素影响，而加工方法对其最终成分施加最强影响。尽管台湾生产多种特色茶，涵盖未发酵、部分发酵和完全发酵类别，但在明确加工阶段对功能成分的综合评估仍有限。因此，在关键制造步骤系统表征代表性茶类型对于阐明生物活性化合物在生产过程中如何形成、降解或转化至关重要。
在影响茶化学的众多因素中，制造序列（包括萎凋、揉捻、发酵（酶促氧化）和烘焙）产生最广泛的生化转化。在此酶促发酵过程中，儿茶素经历酶促氧化生成醌中间体，这些中间体偶联产生茶黄素、茶红素和其他早期氧化二聚体。大部分儿茶素池进一步转化为广泛的次级多酚，这有助于发酵茶的感官和功能特性。发酵后，烘焙期间的长时间热处理可修饰黄酮类化合物，加速氨基酸降解，并促进从没食子酰化儿茶素释放GA。总的来说，这些转变凸显了加工条件在塑造成品茶的化学成分和功能特性中的核心作用。
尽管这些机制已在特定茶类别内单独研究，但跨多个台湾本土茶的全面、阶段解析的化学分析仍未充分探索。台湾生产独特多样的茶，包括未发酵绿茶、轻度氧化乌龙茶以及高度发酵的东方美人和红茶。然而，迄今为止有限的研究系统比较了它们在关键加工阶段的化学转变，或在真实制造条件下检查了配对氧化聚合化合物（POPCs）和茶黄素的形成。在本研究中，术语POPCs用作操作描述符，表示在茶发酵过程中通过酶促氧化和醌介导的反应形成的一组早期儿茶素衍生氧化偶联产物。这些化合物代表沿既定儿茶素氧化途径产生的低分子量氧化二聚体和相关偶联产物，在或与更广泛表征的茶色素（特别是茶黄素）形成同时发生。在更强氧化条件下，此类氧化中间体可能进一步有助于下游色素（如茶黄素）的形成。
相应地，本研究调查了九种代表性台湾本土茶在整个制造过程中发生的化学转变，使用在四个关键点的分阶段采样：绿茶（G）、发酵（F）、烘焙前半成品茶（S）和成品茶（C）。通过量化关键加工阶段的儿茶素、GA、咖啡因、游离氨基酸、POPCs和茶黄素，本研究建立了台湾茶首个全面的过程解析化学数据集，提供机制见解和完善未来制造实践的基础。本研究的目标是：(i) 系统表征台湾本土茶四个关键加工阶段主要生物活性成分（包括儿茶素、没食子酸、游离氨基酸、咖啡因、配对氧化聚合化合物（POPCs）和茶黄素）的阶段解析变化；(ii) 阐明酶促氧化、揉捻和烘焙在茶制造过程中如何差异影响儿茶素的氧化转化途径；(iii) 评估原料特性（品种类型、海拔和叶成熟度）和加工强度对成品茶最终化学成分的相对贡献。
2. Results and Discussion
2.1. Chemical Composition at the Green-Tea Processing Stage
如表1所示，九种代表性台湾本土茶——包括三峡碧螺春绿茶（G）、文山包种茶（P）、高山乌龙茶（H）、冻顶乌龙茶（D）、木栅铁观音茶（M）、东方美人茶（O）、红乌龙茶（R）、小叶种红茶（SB）和大叶种红茶（B）——各自独立制造三次以捕捉实际制造中化学成分的变异性。所有茶均由茶业改良场（桃园，台湾）训练有素的茶师按照台湾本土茶官方标准（CNS 179:2021）加工。随后，在四个代表性加工阶段收集茶样品：未发酵绿茶阶段（G）、发酵阶段（F；通过萎凋或搅拌控制酶促氧化）、烘焙前半成品茶阶段（S）和完全成品茶阶段（C），如表2所示。
九种茶类型的绿茶加工样品（G阶段）在儿茶素衍生物、氨基酸、GA和咖啡因方面表现出不同的化学模式。儿茶素被认为是鲜茶叶的主要多酚成分（黄烷-3-醇），其丰度差异通常反映品种相关特性和采摘实践。与此一致，图2A显示茶类型间总儿茶素（TC）存在显著差异。由精细采摘的芽制造的茶——包括GG、OG和SBG——在小叶类型（G、P、H、D、M、O、R、SB）内显示最高TC水平。非游离儿茶素（NFC）观察到类似趋势，其中这三种茶在小叶茶组内也显示显著更高的浓度。然而，游离儿茶素（FC）在小叶茶类型间无显著差异。当与BG比较时，所有儿茶素参数——TC、NFC和FC——在BG中均显著高于任何小叶茶在绿茶阶段加工的结果。这种差异可部分归因于品种相关差异，因为已知大叶品种比小叶品种含有更高的黄烷醇/儿茶素水平，在发酵前提供更大的底物池。
绿茶加工样品中总游离氨基酸（TFAA）和L-茶氨酸的含量如图2B所示。GG显示最高TFAA，这一结果可能反映青心柑仔的品种特异性特征，而SBG显示最高L-茶氨酸含量。HG，包括从1000、1400和1700米收集的叶材料，显示随着海拔升高TFAA和L-茶氨酸水平逐渐增加，导致较大的误差条。在DG中也观察到类似现象，其中高海拔批次（>1200米）比在500–600米采收的批次含有显著更高的氨基酸水平。高海拔茶园的较低温度、较慢叶生长和强化施肥促进氨基酸积累。Chen等人提出，高海拔生长的茶比低海拔生长的茶积累更多水可提取化合物——包括多酚、儿茶素和游离氨基酸。总的来说，这些观察结果与先前报道的茶植物中氨基酸积累的海拔相关趋势一致，而本研究结果主要突出了在检查的HG和DG样品背景下的这种关系。
在小叶茶类型中，GG和OG显示最高GA含量（图2C）。当包括BG在比较中时，BG显示总体最高GA含量，与在TC和NFC中观察到的趋势一致（图2A）。这表明采摘嫩度和叶大小可能影响GA生物合成和酯水解。青心柑仔（GG）和青心大冇（OG）中 notably 高GA水平也可能表明固有的品种特异性生化特征，这值得未来基于品种的代谢研究。
绿茶加工样品间咖啡因水平显著不同（图2D）。在OG、GG、SBG和BG中检测到最高含量。这些趋势很大程度上与观察到的儿茶素和GA含量趋势平行，并反映采收成熟度，因为在芽-叶阶段采摘的茶（例如，OG采收为一芽一叶）通常保留较高咖啡因水平。Lin等人证明咖啡因含量随采摘位置系统变化，最高含量出现在芽和前几叶，并在较老叶中逐渐下降。这些发现表明品种相关特征、叶成熟度和海拔在加工前塑造初始植物化学成分中起主要作用。绿茶阶段在儿茶素、氨基酸、GA和咖啡因方面的显著差异突出了原料特征作为生化基础的重要性，该基础塑造后续发酵和烘焙结果。应注意，绿茶阶段观察到的变异也反映了茶类型内固有的生物变异性，包括独立制造批次间在品种、海拔和叶成熟度方面的差异。这种变异性代表实际生产条件下的真实原料异质性，并提供后续加工驱动转变发生的生化基线。
2.2. Effects of Fermentation on Chemical Composition Across Taiwanese Tea Types
发酵诱导了儿茶素、GA、氨基酸和下游氧化聚合产物的 distinct 和茶类型特异性变化。在解释发酵诱导变化时，应强调茶类型间差异反映加工强度和原料固有生物变异性，包括品种、海拔和叶成熟度。为评估加工过程中儿茶素氧化程度，计算每种茶类型F与绿茶加工（G）样品的比率（图3A）。五种轻度发酵茶——包括G、P、H、D和M——显示最小TC损失（≤20%），表明萎凋或轻度酶促氧化仅引起单体儿茶素有限降解。相反，重度发酵茶显示显著儿茶素消耗：O、SB和B显示约70% TC损失，而R显示最高减少（约92%）。这些发现与先前研究一致，显示茶树叶中约75%儿茶素在发酵过程中经历酶促氧化和聚合，形成次级多酚化合物，如茶黄素、茶红素、茶黄素、茶橙素和乌龙茶素，这有助于发酵茶的特征颜色和风味。此外，研究表明具有较高初始酯化儿茶素（特别是EGCG和ECG）含量的茶在发酵期间产生更高水平茶黄素，导致更深的浸出颜色和改善的感官品质。先前研究显示，在发酵期间，茶多酚氧化以可预测方式进行，反应速率受分子结构和氧浓度控制。这些结果暗示发酵强度是儿茶素氧化和聚合的主要驱动因素。
在所有茶类型中，GA在发酵后显著增加，在SB中观察到最大增加，其次是R和O（图3B）。先前研究证明，EGCG和ECG易于经历水解和氧化降解，在富氧条件下产生GA和去没食子酰化儿茶素。GA的积累 thus 反映儿茶素生物转化程度和发酵进程。此外，GA有助于发酵茶的苦味、涩味和抗氧化能力，并日益被认为是发酵强度和茶品质的潜在生化指标。总体而言，这些发现表明GA形成不仅是降解副产物，而且是氧化转化途径的组成部分，在塑造发酵茶的化学功能和感官特征中起重要作用。
LC–MS/MS分析揭示茶类型间配对氧化聚合化合物（POPCs）的相对丰度存在明显差异，以半定量方式评估。FC和NFC POPCs显示类似模式。轻度发酵茶（G、P、H、D、M）显示最大相对增加，而重度发酵茶（O、SB、B）仅积累约四分之一，且R显示总体最低水平。先前研究表明，儿茶素被氧化成醌中间体，这些中间体随后偶联并聚合成更高阶色素，如茶黄素、茶红素和茶褐素。这些氧化聚合产物显著贡献茶的颜色和味道。这种逐步进展支持POPCs代表早期氧化偶联产物的解释，这些产物在更强发酵条件下倾向于减少，因为下游氧化产物如茶黄素和茶黄素/茶红素型色素积累。
茶黄素（TSs），另一组主要氧化衍生儿茶素二聚体，受发酵显著影响，如图3D,E所示。经历更强发酵的茶，包括O、R、SB和B，显示总TSs最大相对增加。这种模式表明 prolonged 酶促氧化有利于儿茶素醌中间体之间更广泛偶联。然而，个别TS化合物在茶类型间响应不一致。茶黄素A（TSA）在所有茶中除G和P外显著增加，且增加幅度在O中最大。茶黄素B（TSB）和茶黄素C（TSC）也在所有茶类型中增加，在O、R、SB和B中增加 particularly 显著。相反，茶黄素H（TSH），TSB的异构体，在这些重度发酵茶中显示显著减少，表明TSH可能在发酵后期涉及进一步氧化转变。
本研究中儿茶素衍生氧化产物的鉴定与先前报道的MS/MS碎裂行为一致。与没食子酰部分中性丢失相关的特征碎片离子，连同指示黄烷-3-醇骨架逆狄尔斯-阿尔德裂解的分裂模式，已被广泛报道为发酵茶中儿茶素衍生氧化二聚体（包括早期偶联产物和茶黄素）的诊断特征。在靶向LC–MS/MS工作流程中，这些已建立的分裂特征与保留时间匹配为化合物身份确认提供可靠支持。此类验证MS/MS标准的应用支持本研究中跨不同发酵阶段检测到的氧化儿茶素二聚体的归属。
总的来说，儿茶素、POPCs和茶黄素的协调相对变化支持茶发酵期间逐步氧化转化途径。儿茶素作为酶促氧化的主要底物，产生醌中间体，这些中间体经历早期氧化偶联形成配对氧化聚合化合物（POPCs）。在更强或 prolonged 发酵条件下，这些早期偶联产物进一步转化为结构更明确和稳定的儿茶素二聚体，如茶黄素。这种 proposed 关系和进展示意图如图3F所示，该图整合了文献中报道的代表性偶联 motif 和氧化途径。
与主要关注单一茶类别或最终商业产品的前期研究相比，本研究通过提供多个台湾本土茶在明确制造阶段的 process-resolved 比较扩展当前知识。早期报告广泛表征了儿茶素氧化产物，如茶黄素和茶黄素，主要在发酵后的黑茶或乌龙茶中。相反，此处采用的分阶段采样策略 enables 直接观察早期氧化偶联事件，反映为配对氧化聚合化合物（POPCs），在它们进一步转化为更强发酵条件下结构更明确的色素之前。此外，虽然前期研究报道了儿茶素消耗和没食子酸形成的发酵依赖性趋势，但这些关系通常是从不同条件下生产的成品茶比较中推断的。通过跟踪相同茶类型通过顺序加工步骤，本研究证明POPCs在轻度发酵下优先积累并在发酵强化时下降，从而完善茶制造期间儿茶素氧化途径的时间框架。总的来说，这些发现不矛盾前期报告，而是通过整合早期中间体和加工动力学到统一转变模型来细化它们，提供更机制性理解发酵强度和加工结构如何共同塑造台湾本土茶的化学特征。
发酵也影响含氮化合物，特别是游离氨基酸（图4A,B）。相对于其绿茶阶段对应物，所有茶类型中TFAA增加。其中，B显示最高平均增加（+194%），其次是M（+160%）和G（+153%）。尽管数值在茶类型间变化，但在小叶茶间未检测到统计学显著差异，表明这些茶内观察到的TFAA增加在幅度上可比。
相反，L-茶氨酸根据茶类型显示增加和减少。 Notably，O、R和SB在发酵后显示L-茶氨酸含量最大减少。尽管并非所有比较中这些差异统计学显著，但这三种茶共享涉及 prolonged 萎凋的加工特征。例如，O经历约3小时温暖初夏条件下的日光萎凋，随后 extended 室内萎凋和重复搅拌，导致杀青前 substantial 水分损失。R also 涉及部分发酵茶中最长总萎凋时间，结合日光萎凋和 extended 室内萎凋/搅拌循环。SB在采收后立即经历 overnight 萎凋和杀青前额外揉捻和搅拌步骤。这与先前报告一致，表明萎凋、揉捻和发酵促进茶叶蛋白质水解成游离氨基酸。然而，这些氨基酸在发酵期间经常下降，可能由于它们进一步转化为下游代谢物。
发酵期间咖啡因保持相对稳定（图4C）。跨所有茶，变化不超过20%，且未观察到与发酵强度关联。此结果与先前发现一致，显示咖啡因是茶中最稳定成分之一，基本不受发酵过程影响。咖啡因含量变化更强烈受环境因素影响——如生长区域、气候和采收时间——而非制造步骤。这些结果因此反驳常见误解，即更高发酵降低咖啡因水平。
2.3. Effects of Roasting on Chemical Composition
烘焙在从半成品（S）到成品（C）加工阶段过渡期间进一步修改化学成分（图5）。应注意，仅D、M和R包含在S–C比较中，因为这些茶类型在其制造协议中涉及明确界定和独立的烘焙步骤，允许在烘焙前采样 distinct S。尽管并非所有变化达到统计学显著性，但每种茶类型显示 distinct 响应模式；因此，此处结果讨论基于相对趋势而非统计学显著差异。在D中，烘焙与GA显著增加相关，而大多数其他成分显示适度减少。跨所有三种茶，TFAA和L-茶氨酸在烘焙后显示最大减少，这一趋势与已知含氮化合物对长时间加热期间热降解、脱氨基或美拉德反应的敏感性一致。
茶类型间烘焙条件显著不同，可能贡献其组成结果。D经历平均18.3小时烘焙，达到温度高达115 °C。M经历最 intensive 处理——超过35小时累积烘焙，峰值温度约120 °C——与其TFAA和L-茶氨酸的 pronounced 损失及GA形成一致。相反，R有最短烘焙持续时间（约16小时，最大105 °C）；然而，其TFAA减少超过D。这种差异可能由过程结构差异解释：D在几天内以9–10短周期烘焙，允许间歇水分重新分布和表面冷却，而R仅经历两个长烘焙周期（每个约8小时）。R中有限冷却间隔减少水分平衡机会，并可能强化含氮化合物热应力，导致更大氨基酸损失尽管更温和温度条件。
2.4. Chemical Composition of Completed Teas (C) and the Influence of Rolling
C的化学成分在台湾茶类型间显著不同（图6）。在所有样品中，G显示最高水平的TC、NFC、FC、TFAA、L-茶氨酸和咖啡因（图6A,B）。本研究中观察到的个别儿茶素分布模式与先前使用溶剂基提取方法报告的研究基本一致。例如，Zuo等人报告的绿茶显示非游离儿茶素（NFC）主导，而乌龙茶和黑茶显示较低总儿茶素含量，反映发酵期间逐步氧化转变。尽管绝对儿茶素浓度由于提取溶剂和数据标准化差异不直接可比，但绿茶中NFC的主导及其随发酵度增加逐渐消耗与本研究热水提取样品中观察到的趋势很好对齐。
相反，GA在B中最丰富（6.03 mg/g），其次是O（3.84 mg/g）、SB（2.92 mg/g）和R（2.21 mg/g），如图6B所示。 Notably，本研究中观察到的GA含量与前期研究中相应茶类别报告的值可比。例如，三峡碧螺春绿茶（G, 0.66 mg/g）的GA含量与报告的美福绿茶（0.74 mg/g）相似。同样，木栅铁观音茶（M, 1.35 mg/g）的GA水平与报告的福建乌龙茶（1.42 mg/g）紧密匹配，且小叶种红茶（SB, 2.92 mg/g）的GA含量与报告的福建红茶（2.06 mg/g）可比。尽管提取条件和数据表达存在差异，这些比较与从非发酵绿茶到半发酵乌龙茶和完全发酵黑茶GA含量增加趋势一致。这种一致性支持本测量的分析可靠性，并突出发酵度作为GA积累的关键决定因素。同一茶类型内批次间观察到的 minor 变异可能反映叶成熟度和原料选择差异，这些是手工茶生产固有而非分析不确定性。此外，一批D在图6B中显示较大变异，可能由于采收时使用更成熟叶材料。咖啡因含量在G、O和B中最高——三种由芽丰富原料生产的茶——表明采摘成熟度而非制造步骤是咖啡因水平的主导决定因素。与先前观察一致，Zuo等人 also 提出咖啡因含量不与发酵度成比例缩放，暗示除氧化强度外因素在决定茶中咖啡因水平起主要作用。
为评估揉捻如何影响茶化学，计算C与其前一加工阶段的比率（图6C）。对于G、P、H和O，比较在C和发酵阶段（F）之间进行。对于D、M和R，比较在C和S之间进行。揉捻和球揉对儿茶素产生异质效果。G、P和R显示TC轻微减少（≤5%），而H和D显示适度增加。M和O显示最大TC减少（≥10%），表明O中杀青后保持以及M中应用的传统布球揉捻可能促进额外儿茶素氧化。对于TFAA，G、P和O显示最小变化（<3%），而H、D和R显示更大减少，分别为19%、24%和14%。M经历最 substantial 下降（40%），表明 extended 球揉捻和热积累可能贡献加速氨基酸损失。GA在M中最显著增加（+41%），与观察到的该茶中TC损失一致。咖啡因在所有茶类型间仅显示 minor 波动（约10%），且无显著差异，重申其在揉捻期间相对稳定性。
总的来说，结果证明儿茶素对揉捻相关热和机械应力敏感成分，特别是在以 extended 保持或传统布球揉捻加工的茶中。氨基酸也在这些条件下显示可测量减少，而咖啡因基本不受影响。
3. Materials and Methods
3.1. Chemicals and Reagents
(–)-表没食子儿茶素（EGC, ≥95%）、(–)-表儿茶素（EC, ≥98%）、(–)-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG, ≥95%）、(–)-儿茶素（C, ≥98%）、(–)-没食子儿茶素没食子酸酯（GCG, ≥98%）、(–)-表儿茶素没食子酸酯（ECG, ≥98%）、(–)-没食子儿茶素（GC, ≥98%）、(–)-儿茶素没食子酸酯（CG, ≥98%）、GA、咖啡因、L-茶氨酸和聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）均购自Sigma-Aldrich（圣路易斯，密苏里州，美国）。氯化亚锡（SnCl2）购自Alfa Aesar（沃德希尔，马萨诸塞州，美国）。茚三酮、乙腈（LC级）、甲酸（LC级，85%）、酒石酸钾钠四水合物、硫酸亚铁七水合物（FeSO4·7H2
