《Scientia Pharmaceutica》：Development and Validation of HPLC Methods for the Quantitative Determination and Related Impurities of Naftifine Hydrochloride in Solution and Cream Dosage Forms
摘要
本研究的主要目标是开发用于盐酸萘替芬溶液和乳膏剂型质量控制的方法，重点在于“定量测定”和“有关物质”。研究开发了新颖、精密、准确且环境友好的高效液相色谱（HPLC）方法用于测定盐酸萘替芬及其杂质。“定量测定”采用二极管阵列检测器在254 nm波长下进行，使用等度洗脱的流动相（将1.154 g醋酸铵R溶解于300 mL水R中，随后加入0.2 mL冰醋酸R，混合均匀）和甲醇（30:70）。色谱柱为Gemini C18和Luna C18。“有关物质”的分离在270 nm波长下进行，使用梯度洗脱的流动相，包含10 mM辛烷磺酸钠、0.4 g/L无水磷酸氢二钠溶液（pH 6.5）、乙腈，以及Synergi Hydro-RP色谱柱。根据ICH指南验证的开发方法显示，杂质分析的运行时间为55分钟，活性成分测定的运行时间为6分钟。这些方法已成功应用于溶液和乳膏的质量控制。
1. 引言
抗真菌药物，如盐酸萘替芬，在治疗各种皮肤病中的作用在现代制药实践中得到广泛认可。盐酸萘替芬是一种成熟的抗真菌药，主要用于治疗由皮肤癣菌引起的皮肤感染，如脚气、癣和股癣。它是一种广谱抗真菌药，通过抑制真菌细胞膜重要成分麦角固醇的合成而起作用。该作用导致真菌细胞膜破坏及随后的细胞死亡。盐酸萘替芬局部应用时全身吸收低，使其成为局部治疗的理想选择，最大限度地减少了全身副作用。
鉴于局部抗真菌药物的广泛使用，确保含有盐酸萘替芬的制剂的质量、安全性和有效性至关重要。这些产品的质量控制方法必须精确可靠，以确认活性成分含量且不含有害杂质，从而在最小化患者风险的同时保证疗效。
许多现有方法在灵敏度、特异性、耗时方面面临挑战。因此，越来越需要开发和优化用于药品中这些化合物质量控制的分析技术，确保所使用方法高效、可靠且环境友好。此类方法的优化对于提高分析的准确性和速度、降低质量控制成本以及确保药品的安全性和有效性至关重要。
特别是，当前可用的盐酸萘替芬药典方法要么缺乏对杂质进行全面分析所需的足够选择性，要么不适用于乳膏等复杂基质，或者需要较长的分析时间和高溶剂消耗。这些局限性凸显了需要一种适用于多种剂型的统一、稳健且对环境负责的分析方法。
美国药典（USP）中盐酸萘替芬的专论包含一个用于其含量测定的正相HPLC方法。然而，该方法对于单组分分析而言运行时间相对较长，使其在日常使用中效率低下。除了延长的分析时间外，该过程资源密集：流动相平衡大约需要12小时，色谱柱平衡需要大约4小时。如此苛刻的方案显著增加了时间和资源消耗，增加了操作错误的风险，并可能对结果的准确性产生负面影响。因此，应考虑用于测定萘替芬和杂质的替代分析方法，旨在实现更高的准确性、更有效的资源利用和缩短的分析时间。
对于有关物质的测定，USP专论也使用了相同的正相HPLC方法。然而，该方法存在显著局限性，因为它无法检测萘替芬的所有潜在降解产物。缺乏全面的杂质分析损害了该方法的可靠性，特别是在稳定性研究和质量控制方面。因此，显然需要开发一种新的、更具选择性和稳健的分析程序，能够识别和定量更广泛的萘替芬相关杂质和降解产物。
相比之下，中国药典提出了一种更有利的反相HPLC方法用于盐酸萘替芬的含量测定。然而，它没有规定色谱柱的类型或尺寸，这需要在实施前进行额外的方法验证和优化。对于有关物质的测定，中国药典建议使用与含量测定相同的程序。然而，这种方法不足以全面识别盐酸萘替芬的所有降解产物。因此，该方法需要大量改进以确保准确的杂质分析并适用于稳定性测试。
尽管关于盐酸萘替芬的公开数据很少，但文献检索揭示了更广泛的分析研究致力于特比萘芬，一种结构和药理学上相关的烯丙胺类抗真菌药。这两种化合物具有相似的作用机制，抑制真菌麦角固醇生物合成途径中的角鲨烯环氧化酶，并表现出相似的物理化学性质，如亲脂性和对氧化降解的敏感性。这些相似性表明，应用于特比萘芬的分析策略可为开发盐酸萘替芬的方法提供有用的基础。然而，由于制剂基质、杂质谱和监管要求的差异，已报道的特比萘芬方法需要适应我们特定的实验条件。因此，显然需要设计和验证新的、优化的程序，专门用于盐酸萘替芬的定量测定和杂质分析。
最近，Shinde等人（2025年）报道了一种用于制剂产品中盐酸萘替芬定量估计的RP-HPLC方法。虽然该研究为含量测定提供了一种有用的方法，但它主要关注主要活性成分，并未提供有关物质或降解产物的详细分析。这一局限性进一步凸显了需要一种定制的分析程序，能够对溶液和乳膏剂型进行全面的杂质分析。
本研究的目的是开发用于盐酸萘替芬溶液和乳膏剂型质量控制的分析方法，重点关注“定量测定”和“有关物质”参数。本研究介绍了一种新颖的反相HPLC方法，旨在用于质量控制实验室的常规应用。所提出的方法确保了更快、更准确和资源高效的分析，解决了现有药典方法的局限性，并满足工业药物测试的实际需求。
2. 材料与方法
2.1. 化学品与试剂
盐酸萘替芬溶液和乳膏购自当地药房。活性药物成分盐酸萘替芬（分子式 C21H21N·HCl，分子量 323.86 g/mol，HPLC纯度 ≥ 99.0%）的对照品，及其指定杂质——N-甲基-1-萘甲胺盐酸盐（分子式 C10H7CH2NHCH3·HCl，分子量 207.70 g/mol，HPLC纯度 ≥ 97.5%）和反式肉桂醛（分子式 C6H5CH=CHCHO，分子量 132.16 g/mol，HPLC纯度 ≥ 99.0%）。
用于制备安慰剂溶液的辅料包括：丙二醇、96%乙醇和纯化水。用于安慰剂乳膏的辅料包括：肉豆蔻酸异丙酯、鲸蜡硬脂醇、鲸蜡醇棕榈酸酯、失水山梨醇月桂酸酯、聚山梨酯60、苯甲醇、氢氧化钠和纯化水。安慰剂制剂是通过以与相应商业产品相同的比例混合辅料制备的，不含活性药物成分，确保基质组成与测试制剂相同。
所有标有“R”的试剂（例如乙腈R、Na2HPO4R）均为分析纯，并符合欧洲药典规定的纯度要求。该标记表明试剂适用于分析和制药目的。
使用的化学品——醋酸铵、冰醋酸、甲醇、乙腈、辛烷磺酸钠和磷酸——为梯度级，购自Merck公司。分析使用的去离子水由Stilman公司内部生产，电导率低于0.5 μS/cm。
使用的HPLC色谱柱包括：Gemini C18 50 mm × 4.6 mm, 3 μm、Luna C18 50 mm × 4.6 mm, 3 μm 和 Synergi Hydro-RP 250 mm × 4.6 mm, 4 μm。使用的色谱柱购自Phenomenex公司。本研究使用Agilent 1200 Infinity系统，配备二极管阵列检测器。
色谱数据采集和处理使用Agilent OpenLAB CDS软件2.8版进行。峰积分和峰面积计算自动进行，必要时进行手动审查。
验证参数的统计评估，包括精密度、准确度、线性和耐用性，使用Microsoft Excel 2024进行。计算了重复测量的平均值、标准偏差和相对标准偏差。
使用的其他仪器设备包括：Mettler Toledo XPE-205分析天平、Mettler Toledo Seven Easy pH计和Elmasonic P超声波清洗槽。
用于样品制备的注射器过滤器包括再生尼龙0.2 μm和0.45 μm过滤器，以及聚四氟乙烯0.2 μm和0.45 μm过滤器，购自Phenomenex公司。再生纤维素0.45 μm注射器过滤器购自Choice公司。
2.2. 样品制备与色谱条件
2.2.1. 盐酸萘替芬溶液和乳膏中杂质测定的样品制备与色谱条件
缓冲溶液：将0.4 g无水磷酸氢二钠R和2.34 g辛烷磺酸钠R溶解于1000 mL色谱用水R中，用磷酸调节pH至6.5。
流动相A：缓冲溶液和乙腈R按80:20 (v/v)比例混合。
流动相B：缓冲溶液和乙腈R按5:95 (v/v)比例混合。
稀释剂：乙腈R。
测试溶液制备（乳膏剂型）：精密称取相当于400 μg/mL盐酸萘替芬的乳膏量，溶解于稀释剂中。混合物在45°C超声波浴中超声处理15分钟。冷却至室温后，用相同稀释剂稀释至最终体积，充分混合，并通过0.2 μm再生尼龙注射器过滤器过滤，弃去前5 mL滤液。
测试溶液制备（溶液剂型）：制备含有400 μg/mL盐酸萘替芬的稀释剂溶液。
对照品溶液制备：制备含有2 μg/mL对照品（盐酸萘替芬、N-甲基-1-萘甲胺盐酸盐和反式肉桂醛）的稀释剂溶液。
色谱条件：在配备分光光度检测器的液相色谱仪上进行色谱分析，条件如下：250 mm × 4.6 mm十八烷基硅烷柱，4 μm (Synergi Hydro RP)；流速：1.0 mL/min；检测波长：270 nm；柱温：40°C；进样体积：15 μL；洗脱模式：梯度洗脱，程序按表1进行。
系统适用性要求：对照品溶液三次重复进样的反式肉桂醛、N-甲基-1-萘甲胺盐酸盐和盐酸萘替芬峰面积的相对标准偏差不大于2.9%；N-甲基-1-萘甲胺和反式肉桂醛对应峰之间的分离度因子不小于5.0。
杂质限度：N-甲基-1-萘甲胺盐酸盐不超过0.5%；反式肉桂醛不超过0.5%；未知杂质不超过0.5%；总杂质不超过1.0%。
2.2.2. 盐酸萘替芬溶液和乳膏定量测定的样品制备与色谱条件
流动相：醋酸铵溶液和甲醇R按30:70 (v/v)比例混合。醋酸铵溶液通过将1.154 g醋酸铵R溶解于300 mL色谱用水R中，随后加入0.2 mL冰醋酸R并彻底混合制备。
稀释剂：甲醇R。
测试溶液制备（乳膏剂型）：精密称取相当于80 μg/mL盐酸萘替芬的乳膏量，转移至容量瓶中，溶解于稀释剂中。混合物在45°C超声波浴中超声处理约5分钟，直至乳膏基质完全溶解。冷却至室温后，用相同稀释剂稀释至刻度，充分混合。所得溶液通过0.45 μm膜过滤器过滤，进样前弃去前5 mL滤液。
测试溶液制备（溶液剂型）：制备含有80 μg/mL盐酸萘替芬的稀释剂溶液。
对照品溶液制备：制备含有80 μg/mL盐酸萘替芬对照品的稀释剂溶液。
色谱条件：在配备分光光度检测器的液相色谱仪上进行色谱分析，条件如下：50 mm × 4.6 mm十八烷基硅烷柱，3 μm (Gemini C18或Luna C18)；流速：1.0 mL/min；检测波长：254 nm；柱温：25°C；进样体积：10 μL；等度洗脱。
系统适用性要求：盐酸萘替芬峰的对称因子在0.8至1.8之间；基于三次重复进样，盐酸萘替芬峰的相对标准偏差不大于1.0%；盐酸萘替芬峰的理论塔板数至少为2000。
盐酸萘替芬含量应在溶液中介于9.5至10.5 mg/mL，在乳膏中介于9.5至10.5 mg/g。
2.3. HPLC方法验证
所有验证活动均按照ICH分析程序验证：文本和方法学，Q2(R2)的要求进行。
2.3.1. 盐酸萘替芬溶液和乳膏杂质测定HPLC方法验证
为评估专属性，验证了盐酸萘替芬及其指定杂质的峰与稀释剂和药品其他组分的峰之间无干扰。
为评估线性，在稀释剂中制备了八种分析物溶液，覆盖以下浓度范围：反式肉桂醛、N-甲基-1-萘甲胺盐酸盐和盐酸萘替芬为0.19–2.80 μg/mL，对应于杂质含量0.05–0.7%。
准确度研究中，制备了九个模型溶液，包含三个浓度水平（每个水平三份重复）。每份溶液在测试溶液中加入了已知量的杂质。另外，在不添加杂质的情况下，在相同水平制备了三份平行测试溶液。为两种剂型分别制备溶液。
精密度在重复性和中间精密度水平进行评估。在重复性条件下，为每种剂型制备了六份重复测试溶液。在中间精密度条件下，为每种剂型制备了十二份重复测试溶液。
此外，通过有意改变色谱条件（包括柱温、流速、流动相组成以及使用不同批次/序列号的色谱柱）来评估杂质方法的耐用性。该方法在这些变化下表现出稳定的性能，证实了其适用于常规质量控制。
2.3.2. 盐酸萘替芬溶液和乳膏定量测定HPLC方法验证
为评估专属性，确认了盐酸萘替芬峰与溶剂混合物或药品其他组分峰之间无干扰。
线性在57 μg/mL至107 μg/mL的浓度范围内使用七种溶液进行评估。
方法的准确度使用九种含有安慰剂和目标分析物的模型溶液进行评估，浓度范围如下：溶液为64 μg/mL至95 μg/mL (80–120%)，乳膏为72 μg/mL至97 μg/mL (90–121%)。
精密度在重复性和中间精密度水平进行评估。在重复性条件下，为每种剂型制备了六份重复测试溶液。在中间精密度条件下，为每种剂型制备了十二份重复测试溶液。
定量方法的耐用性同样通过改变柱温、流速、流动相组成以及使用不同批次/序列号的色谱柱进行评估。该方法在这些条件下保持了可接受的准确度和精密度，证明了其适用于常规分析的可靠性。
3. 结果
3.1. HPLC方法开发
开发用于萘替芬溶液和乳膏质量控制方法的第一步是创建适用于质量控制实验室常规使用的HPLC方法，符合“定量测定”和“杂质”的要求。
3.1.1. 溶液和乳膏中杂质测定的HPLC方法开发
开发了一种梯度RP-HPLC方法以改善结构相似的萘替芬相关杂质的分离。在方法开发过程中，评估了最初为含量测定优化的条件用于杂质分析；然而，关键杂质（N-甲基-1-萘甲胺盐酸盐和反式肉桂醛）显示出保留不足，并在死体积附近与安慰剂组分共洗脱（k′ ≈ 0）。随后对梯度条件和有机溶剂含量的优化未能提供足够的选择性，需要进一步修改色谱参数以实现满意的杂质分离度。
为了改善保留和分离度，在色谱柱筛选中系统地评估了长度为50 mm、150 mm和250 mm的色谱柱，试图延迟干扰峰的洗脱。未研究300 mm长度的色谱柱，因为使用250 mm色谱柱已实现满意的目标杂质分离。此外，将色谱柱长度延长至250 mm以上预计会显著增加分析时间，这与开发适用于常规质量控制的快速实用方法的目标相悖。然而，仅使用250 mm色谱柱并未实现与安慰剂组分的有效分离。随后，评估了更强的离子对试剂——如辛烷磺酸钠（10 mM和20 mM）和十二烷基硫酸钠——与乙腈作为有机改性剂结合使用，以保持稀释剂相容性并避免色谱分离过程中的不利影响。尽管更强的离子对试剂增强了保留，但未能实现基线分离或杂质与干扰峰之间的足够选择性。
在使用不同固定相的色谱柱筛选中，观察到N-甲基-1-萘甲胺盐酸盐的峰经常表现出较差的色谱行为，包括峰分裂或不可接受的对称性（拖尾因子 > 2.5）。此行为可能与分析物的碱性性质及其与固定相上残留硅醇基团的强次级相互作用有关。
鉴于这些局限性，重点转向流动相的pH调节。选择辛烷磺酸钠而非十二烷基硫酸钠，因其起泡倾向更低且处理性能更好。10 mM辛烷磺酸钠溶液的初始pH约为4.5。为了提高pH并改变分析物洗脱，加入了磷酸氢二钠，浓度为0.2、0.4和0.6 g/L，并使用磷酸将最终pH调节至7.0、6.5、6.0、5.5和5.0。
尽管Synergi Hydro-RP色谱柱未能为N-甲基-1-萘甲胺盐酸盐提供理想的峰形，但它在测试的色谱柱中表现出最佳的整体性能。在优化条件下和耐用性研究中，该杂质的峰对称性在1.4至1.8之间，满足方法接受标准并确保了足够的准确度和精密度。因此，选择该色谱柱作为色谱性能、耐用性和实际适用性之间的最佳折衷方案。
使用Synergi Hydro-RP色谱柱（250 × 4.6 mm, 4 μm）实现了最佳的色谱性能——定义为分离度、峰对称性和效率——该柱为极性杂质提供了合适的保留，同时确保了与水相流动相的兼容性。
pH优化研究的结果表明，缓冲液pH为6.5时在分离度、对称性和效率之间提供了最佳折衷。在此pH下，观察到盐酸萘替芬与两种杂质之间满意的分离度，同时最小化了与安慰剂成分的共洗脱。因此，选择pH 6.5用于最终方法。
方法开发中的一个重要考虑是需要统一盐酸萘替芬溶液和乳膏剂型的分析程序。因此，稀释剂的选择不仅受色谱兼容性指导，还受有效溶解乳膏基质能力的指导。在测试的两种稀释剂——乙腈和甲醇——之间，甲醇最初显示出对乳膏基质的优异溶解能力。然而，在准确度评估期间，用甲醇制备的测试溶液表现出化学不稳定性。具体而言，观察到反式肉桂醛的显著降解，第一次进样后降解约5%，随后进样额外损失1–3%。此外，在约13分钟保留时间处出现了一个新的未知降解产物。相比之下，乙腈为肉桂醛提供了稳定的环境，使其成为最终方法的优选稀释剂。
作为持续方法开发的一部分，评估了流动相A和B中缓冲溶液和有机组分的不同比例，以改善杂质分离。同时，尝试通过修改梯度程序来缩短色谱运行时间。基于实验结果选择了流动相的最终组成，该组成确保了两个不同批次色谱柱上的最佳色谱性能。
在优化条件下获得的对照品溶液代表性色谱图显示，观察到的峰按以下顺序出现：首先是反式肉桂醛；其次是N-甲基-1-萘甲胺盐酸盐；最后是盐酸萘替芬的主峰。该顺序证实了对照品的身份和纯度，以及HPLC方法分离活性成分与其指定杂质的能力。相比之下，测试溶液的色谱图包括盐酸萘替芬的主峰、其杂质峰（顺序相同）以及由乳膏基质产生的额外安慰剂峰。这些观察结果说明了所开发方法区分测试样品中活性成分、其杂质和辅料峰的能力。
3.1.2. 盐酸萘替芬溶液和乳膏定量测定的HPLC方法开发
成功开发了一种可靠且环境友好的HPLC方法，用于测定药物剂型中的盐酸萘替芬。该方法使用等度洗脱系统，流动相为（醋酸铵溶液：将1.154 g醋酸铵R溶解于300 mL水R中，加入0.2 mL冰醋酸R，并彻底混合）-甲醇（30:70）。测试了以下稀释剂：
甲醇
流动相（醋酸铵溶液：将1.154 g醋酸铵R溶解于300 mL色谱用水R中，加入0.2 mL冰醋酸R，并彻底混合）-甲醇（30:70）
研究结果如表3所示。
选择甲醇作为稀释剂，因为：
它提供更好的峰对称性。
色谱柱效率超过2000理论塔板数。
甲醇对乳膏基质的溶解性明显更好，这有利于统一两种产品的分析方法。
在溶液形式的样品制备过程中，未观察到沉淀。然而，对于1%萘替芬乳膏，测试溶液需要过滤以去除不应存在于分析样品中的乳膏基质。为确保结果的可靠性和准确性，测试了各种类型的过滤器。对于每种过滤器类型，弃去前5 mL滤液。
研究结果如表4所示。
研究结果表明，所有测试的过滤器类型均具有良好的回收率和有效的过滤效果。这表明每种评估的过滤器都能够提供必要水平的样品纯化。
由于文献仅规定了色谱柱的类型（填充十八烷基硅烷硅胶，C18），通过实验测试了来自不同制造商和不同尺寸的各种色谱柱。结果如表5所示。
基于获得的结果，选择了Gemini C18 (50 × 4.6 mm, 3 μm)和Luna C18 (50 × 4.6 mm, 3 μm)色谱柱，因为它们对盐酸萘替芬峰表现出最高的理论塔板数，并提供了最佳的峰对称性。
盐酸萘替芬的保留时间为4.8分钟。使用10 μL的进样体积，254 nm的最佳检测波长提供了最高的灵敏度，且无稀释剂峰干扰。1.0 mL/min的流速被确认可在合理的运行时间内实现高效分离，确保了该方法用于常规分析的实用性。
3.2. 方法验证
该程序根据国际人用药品注册技术协调会（ICH）的标准进行了验证。
3.2.1. 溶液和乳膏中杂质测定HPLC方法验证结果
为确认方法的有效性，研究了以下参数：专属性；应用范围内的线性；准确度；精密度；和定量限（LOQ）。用于计算的公式见附录A。验证结果摘要见附录B，表A1和附录C，表A2。
加标样品中杂质和其他组分的分离是合适的。反式肉桂醛、N-甲基-1-萘甲胺盐酸盐和盐酸萘替芬的峰与基质峰之间未获得干扰。
线性回归参数根据ICH分析程序验证：文本和方法学，Q2(R2)的建议计算。获得的相关系数证实了该方法对反式肉桂醛、N-甲基-1-萘甲胺盐酸盐和盐酸萘替芬杂质分析的优异线性（表6，附录B，表A1，附录C，表A2）。
使用加标方法评估了参数准确度和精密度，将反式肉桂醛和N-甲基-1-萘甲胺盐酸盐加入测试溶液中，分析了12份溶液重复样和12份乳膏重复样。回收率和RSD评估了由分析员1分析的6份重复样和由分析员2分析的6份重复样，包括溶液和乳膏，以及两位分析员结果之间的差异。结果如表7和表8所示。
该方法对反式肉桂醛、N-甲基-1-萘甲胺盐酸盐和每个未知杂质的定量限确定为0.10%，满足LOQ ≤ 0.1%的可接受标准。
使用反式肉桂醛、N-甲基-1-萘甲胺盐酸盐和盐酸萘替芬的对照品计算反式肉桂醛、N-甲基-1-萘甲胺盐酸盐和每个未知杂质的含量。
3.2.2. 盐酸萘替芬溶液和乳膏定量测定HPLC方法验证结果
为评估开发的HPLC方法的性能，根据ICH指南Q2(R2)“分析程序验证：文本和方法学”评估了关键验证参数，包括专属性、应用范围内的线性、准确度和精密度。用于计算的公式见附录A，详细的验证结果见附录C，表A2。
在盐酸萘替芬的工作浓度范围内计算了线性回归参数。该方法表现出优异的线性，相关系数（r）为0.99954，表明几乎完美的线性关系（表9，附录D，表A3，附录E，表A4）。
通过回收率研究确认了方法的准确度，显示溶液的个体回收率值在99.6%至101.3%之间，乳膏在99.5%至100.8%之间。
