《Animal Nutrition》：Proline promotes prolyl 4-hydroxylase subunit alpha 1 via transforming growth factor beta 1 to increase the synthesis and deposition of collagen in grass carp (
Ctenopharyngodon idellus) muscle fibroblasts: Insights from integrated bioinformatics and functional analysis
编辑推荐：
本研究针对如何提升草鱼肌肉品质这一产业问题，通过整合生物信息学与功能分析，揭示了脯氨酸（Pro）通过激活转化生长因子β1（TGFβ1）信号通路上调关键酶脯氨酰4-羟化酶亚基α1（P4HA1），进而促进胶原合成与沉积的新机制。该发现为通过营养调控靶向改善水产动物肌肉质地提供了重要理论依据。
在全球水产养殖业中，草鱼（Ctenopharyngodon idella）的产量位居首位，2022年达到了620万吨。作为草鱼主要的可食部分，肌肉的品质备受关注，其中肌肉硬度是影响消费者接受度的关键性状，较高的硬度还能增强鱼体在加工和储存过程中的稳定性。因此，如何提升草鱼肌肉硬度成为近年来水产养殖业的研究焦点。
肌肉主要由肌纤维和结缔组织构成。结缔组织中的胶原蛋白是决定肌肉硬度的关键结构成分，其含量和分子交联程度至关重要。胶原由成纤维细胞合成和分泌，其合成过程涉及一系列复杂的翻译后修饰，其中脯氨酰4-羟化酶（P4H）催化的脯氨酸（Pro）残基羟基化是稳定胶原三股螺旋结构的关键步骤。P4H由α和β亚基组成，其中α亚基的P4HA1被认为是胶原合成的限速酶。另一方面，转化生长因子β（TGFβ）超家族，特别是其经典的TGFβ/SMADs信号通路，是调控胶原代谢的核心通路。有研究表明，TGFβ1可能通过上调P4HA1的表达来促进胶原合成，然而这一调控关系在鱼类中尚不清楚。此外，脯氨酸作为胶原中含量最丰富的氨基酸之一，不仅是胶原合成的底物，也可能参与调控胶原代谢，但其在鱼类肌肉中的具体作用机制仍有待阐明。
为了解决上述问题，发表在《Animal Nutrition》上的这项研究，综合运用了基因克隆与生物信息学分析、细胞培养、RNA干扰（siRNA）、实时定量PCR（RT-qPCR）、蛋白质印迹（Western Blot）以及天狼星红染色测定胶原含量等技术方法。研究的样本来源于草鱼的肌肉组织及其分离培养的肌肉成纤维细胞。
3.1. P4HA1的基因鉴定
研究人员首先克隆了草鱼肌肉P4HA1的编码序列（CDS）。生物信息学分析显示，该CDS全长1623 bp，编码540个氨基酸，预测分子量约为61.78 kDa，理论等电点为6.47。序列分析表明，该蛋白包含一个信号肽和一个脯氨酰4-羟化酶α亚基同源结构域（P4Hc）。同源性比较和系统进化树分析发现，草鱼P4HA1与红鳍原鲌（Chanodichthys erythropterus，95.96%）和团头鲂（Megalobrama amblycephala，95.77%）的相似性最高，并与其它鱼类聚为一支，而与小鼠（Mus musculus）和人类（Homo sapiens）等哺乳动物区分开来。这些结果表明P4HA1在进化上较为保守。
3.2. P4HA1基因敲低降低胶原含量和P4HA1表达
为了验证P4HA1在胶原合成中的功能，研究者在草鱼肌肉成纤维细胞中使用了三种不同的siRNA进行基因敲低。结果显示，siRNA-1的敲低效率最高，能显著降低P4HA1的mRNA和蛋白表达水平。更重要的是，P4HA1敲低后，通过天狼星红染色测定的总胶原含量显著下降，同时胶原基因COL1A1、COL1A2和COL5A1的mRNA表达水平也显著下调。这直接证明了P4HA1是草鱼肌肉胶原合成的关键基因。
3.3. 脯氨酸影响细胞活力、胶原含量和P4HA1表达
接下来，研究探讨了不同浓度脯氨酸（0, 0.3, 0.6, 0.9, 1.2, 1.5, 3 mmol/L）对细胞的影响。细胞活力实验表明，0.9 mmol/L的脯氨酸对细胞活力无显著负面影响。功能分析发现，脯氨酸处理能剂量依赖性地增加总胶原含量以及COL1A1、COL1A2、COL5A1和P4HA1的mRNA表达，且在0.9 mmol/L时效果最显著。这表明脯氨酸不仅能作为底物，还可能上调P4HA1的表达来促进胶原合成。
3.4. 脯氨酸和siP4HA1共处理对胶原含量和P4HA1表达的影响
为了进一步确认脯氨酸通过P4HA1发挥作用，研究设置了共处理实验。结果显示，单独添加0.9 mmol/L脯氨酸能上调胶原相关指标，而敲低P4HA1则抑制这些指标。在敲低P4HA1后，再补充脯氨酸，可以部分逆转因基因敲低导致的胶原含量和相关基因表达的下调，尽管无法完全恢复到单独添加脯氨酸的水平。这强有力地说明脯氨酸促进胶原合成的作用至少部分是通过上调P4HA1的表达来实现的。
3.5. 脯氨酸激活草鱼中的TGFβ/SMADs通路
机制探索方面，研究发现脯氨酸处理能显著上调TGFB1和SMAD4的mRNA表达，并显著提高SMAD2（Ser250）和SMAD3（Ser423/Ser425）的磷酸化水平，同时也能上调SMAD3的蛋白总量。这表明脯氨酸能够激活TGFβ/SMADs信号通路。
3.6. TGFB1基因敲低降低胶原含量以及P4HA1和TGFB1的表达
为了验证TGFB1的上游调控作用，研究者敲低了TGFB1。结果发现，TGFB1敲低后，总胶原含量以及COL1A1、COL1A2、COL5A1和P4HA1的mRNA表达均显著下降。这提示TGFB1是胶原合成的重要正向调节因子，并且可能位于P4HA1的上游。
3.7. 脯氨酸和siTGFB1共处理对胶原含量以及P4HA1和TGFB1表达的影响
最后的共处理实验表明，在敲低TGFB1后，脯氨酸提升胶原含量以及P4HA1、COL1A1、COL1A2表达的能力被显著削弱。这说明脯氨酸对胶原合成的促进作用，很大程度上依赖于TGFB1的正常功能。
综上所述，本研究得出核心结论：在草鱼肌肉成纤维细胞中，脯氨酸通过上调TGFB1的表达，激活TGFβ/SMADs信号通路，进而促进关键胶原合成酶基因P4HA1的表达，最终增加了胶原的合成与沉积。
这项研究的意义在于，首次在草鱼中系统地揭示了从营养因子（脯氨酸）到信号通路（TGFβ1），再到关键酶（P4HA1），最终影响胶原代谢的完整调控轴（Pro-TGFβ1-P4HA1轴）。这不仅深化了对鱼类胶原代谢调控网络的理解，而且为通过日粮精准添加脯氨酸来改善草鱼等水产动物的肌肉品质提供了直接的理论基础和实践指导，有助于推动水产养殖从“量产”向“质优”的转变。未来需要进一步的体内实验来验证这些体外研究发现，并探索在其他鱼类中的普适性。
