《Aquatic Toxicology》：A metabolomics study unravels the hepatotoxic mechanism of diuron in zebrafish: Disruption of glutathione synthesis and mitochondrial energy metabolism
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肝毒性机制；代谢紊乱；三羧酸循环；生物富集；苯甲酸代谢
施静静|罗天丽|王壮|任曦|冉月宇|彭月汉|刘国|威利·佩延伯格
中国成都理工大学地质灾害防治与地球环境保护国家重点实验室，成都，610059
摘要
肝脏在异生物质代谢中起着核心作用，因此极易受到化学物质的损伤。然而，敌草隆引起的肝毒性的机制仍不甚明了。本研究将斑马鱼（Danio rerio）暴露于50和500 μg/L的敌草隆环境中21天，随后利用生理学、生物化学和代谢组学技术综合分析其肝毒性。结果显示，敌草隆在斑马鱼体内显著积累，生物浓缩系数（BCF）范围为14.0至40.49 L/kg。组织分布分析表明，肝脏是主要积累部位（491.48 ± 19.48 ng/g），而在500 μg/L的暴露浓度下，大脑也出现了大量积累（334.84 ± 10.90 ng/g）。进一步研究敌草隆在肝脏中的代谢过程，发现了通过脱甲基化、水解、氧化和C-N键断裂产生的13种代谢物。这些代谢变化与组织病理损伤、氧化应激和脂质过氧化相关。非靶向代谢组学分析还揭示了关键代谢途径的显著紊乱，尤其是精氨酸代谢和三羧酸循环（TCA循环）。从机制上看，敌草隆引起的斑马鱼肝毒性表现为关键代谢物（如γ-谷氨酰酪氨酸、亮氨酸脯氨酸和苹果酸）的表达下调，这些变化共同导致了三羧酸循环以及花生四烯酸、谷胱甘肽和精氨酸代谢途径的紊乱。这些发现有助于加深对肝脏代谢紊乱的理解，为化学品的生态风险评估提供宝贵见解，并为敌草隆引起的肝毒性提供新的机制认识。
引言
敌草隆是一种广泛使用的苯脲类除草剂，通过阻断植物和藻类中叶绿体膜向光系统II（PSII）的电子转移来抑制光合作用（Xie等人，2025年）。农业应用后，未被吸收的敌草隆及其代谢物会进入水生系统。监测数据显示其在水中的广泛存在：在西班牙的Llobregat河中浓度达到0.24 μg/L（Rodriguez-Mozaz等人，2004年），在英国南安普顿河口峰值达到6.74 μg/L（Konstantinou和Albanis，2004年）。在日本农田附近，浓度高达4.62 μg/L（Kaonga等人，2015年）；在中国横沙岛附近的海域，敌草隆的检测浓度为83.48至369.25 ng/L，检出率为100%（Luo等人，2024年）。全球范围内，淡水中的敌草隆浓度通常在42至526 ng/L之间（Batista-Andrade等人，2016年；Kim等人，2014年；Mijangos等人，2018年），最高报告浓度为3.3 μg/L（Albuquerque等人，2016年；Masia等人，2015年）。作为海洋防污涂料的成分，敌草隆也是海洋环境中的农药污染源之一（Ali等人，2014年；Ansanelli等人，2017年；Okamura等人，2003年）。这种广泛而持久的存在导致水生生态系统持续暴露于敌草隆，增加了其潜在生态风险，亟需明确其长期毒理学影响。
敌草隆对多种水生生物具有广谱毒性，影响范围从初级生产者到脊椎动物。除了抑制光合作用外，它还会在藻类和植物中引发次级氧化应激，表现为硅藻中SOD和MDA水平的升高（Singh和Singla，2019年；Hao等人，2022年）。在无脊椎动物（如牡蛎）中，敌草隆会降低甲基转移酶活性，表明存在表观遗传和基因毒性干扰（Akcha等人，2021年）；在卤虫中，它会通过干扰孵化酶影响胚胎发育（Alyuruk和Cavas，2013年）。
除了这些特定生物和生命阶段的效应外，敌草隆还会引起一系列系统性的毒性后果，包括基因毒性、细胞毒性、胚胎毒性、免疫毒性以及内分泌、呼吸和心血管功能的紊乱（Da Rocha等人，2013年；Behrens等人，2016年；Remucal，2014年；Lima等人，2024年）。特别值得关注的是其对器官的特异性损伤，由于肝脏在异生物质代谢中的核心作用，肝脏成为主要靶标。哺乳动物研究指出敌草隆及其代谢物与肝毒性相关，这与代谢紊乱有关（da Silva Sim?es等人，2017年）。在鱼类中，现有的毒理学数据主要关注急性致死性或胚胎效应（Kao等人，2019年），但对于慢性、亚致死性肝毒性的机制了解不足——这是评估实际环境风险的关键点。
鉴于敌草隆的系统性毒性，其在水生生物（尤其是鱼类）中的生物积累潜力可能进一步加剧其生态风险。这种潜力受其物理化学性质的影响，包括适度的疏水性（log Kow ≈ 2.8）和持久的苯环结构，这些特性促进了其在环境中的持久性和在生物组织中的积累（Inoue等人，2012年）。虽然结构相似的除草剂在鱼类中的积累模式有所不同，但敌草隆在鱼类中的具体毒代动力学（包括吸收、分布和清除）仍不明确。
同时，调节敌草隆积累和毒性的关键因素是生物转化，主要发生在肝脏中。这一代谢过程显著影响污染物（如敌草隆）的生物积累潜力（Wang等人，2024年）。已知某些农药在肝脏中的生物转化会产生比原化合物更具毒性的代谢物（Phogat等人，2022年）。类似的现象也发生在敌草隆在其他生物中，其代谢物3,4-二氯苯胺（3,4-DCA）和3,4-二氯苯基-N-甲脲（DCPMU）引起的不良效应比敌草隆更严重（Stork等人，2008年）。先前研究发现，敌草隆在水生环境中主要通过自水解产生3,4-DCA。3,4-DCA是环境中最持久的敌草隆代谢物（Xiang等人，2018年），会对水生生物造成严重毒性。已有研究探讨了3,4-DCA对多种生物指标的影响，包括繁殖（Ensenbach和Nagel，1997年）、生物化学（Monteiro等人，2006年；Valentovic等人，2001年）和形态变化（Scheil等人，2009年）。此外，敌草隆在多种生态系统的组织中均有检测到，引发了对其在水生食物链中传播的担忧（Akcha等人，2021年；Bouzidi等人，2024年；Mohamat-Yusuff等人，2021年）。关于敌草隆在水生生物中的生物转化的研究较少。鉴于其生物积累潜力和复杂的生物毒性，迫切需要对其在生物体层面的影响和毒性机制进行更详细的研究。
本研究采用“暴露-积累-代谢-毒性”综合框架，系统探讨了敌草隆在斑马鱼模型中的肝毒性机制。首先确定了急性毒性并建立了具有环境意义的慢性暴露浓度。随后通过体内实验表征了生物积累动力学，利用生理学、生物化学和分子学方法全面分析了肝毒性机制。这一多尺度研究为敌草隆的毒理学机制提供了新见解，有助于改进这种新兴水污染物的生态风险评估。
实验材料
实验中使用的敌草隆标准品购自上海Aladdin生化科技有限公司。甲醇和乙腈（均为色谱级）也来自同一供应商。实验试剂盒包括超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、总蛋白（TP）、谷氨酸-草酰乙酸转氨酶（AST）和谷氨酸-丙酮酸转氨酶（ALT）以及过氧化氢酶（CAT）检测试剂，均来自南京建城生物工程研究所
整鱼体内敌草隆的吸收与消除
对照组中未检测到敌草隆，而暴露组（50和500 μg/L）的浓度在整个实验过程中保持稳定，偏差≤20%（图S3）。两个暴露组的体重下降模式相似。例如，斑马鱼的体重从第1天的0.21 ± 0.02 g（50 μg/L）和0.20 ± 0.01 g（500 μg/L）下降到第14天的0.17 ± 0.01 g和0.16 ± 0.02 g（图1.A）。观察到的体重减轻和Fulton指数下降
结论
本研究证实了敌草隆暴露（50和500 μg/L）与显著的肝毒性之间的关联，这与代谢紊乱有关。敌草隆在肝脏中的大量积累及其在大脑中的检测表明其具有潜在的系统毒性。基于我们的非靶向代谢组学数据，我们认为敌草隆的毒性机制可能涉及中央能量和代谢途径（特别是三羧酸循环）的紊乱。
数据获取
数据可应要求提供
资助声明
本研究得到了国家自然科学基金（42307375）和四川省自然科学青年基金（2022NSFSC1076）的支持。
支持信息：这些支持数据为本研究提供了分析方法验证、毒代动力学参数和代谢组学数据的详细证据。
未引用的参考文献
Hoseini等人，2020年；Mohamat-yusuff等人，2020年；Simoes等人，2017年
CRediT作者贡献声明
施静静：方法学设计、实验实施、数据分析、初稿撰写、审稿与编辑。罗天丽：项目指导、方法学设计、数据分析、审稿与编辑、资金申请。王壮：方法验证、实验实施、数据分析。任曦：撰写、审稿与编辑、数据管理。冉月宇：撰写、审稿与编辑、数据管理。彭月汉：实验设计、软件操作。刘国：项目指导、方法学设计。威利·佩延伯格：项目指导、撰写
