《Applied Microbiology》：Evaluation of the Capacity of Purple Nonsulfur Bacteria from In-Dyke Alluvial Soil to Solubilize Mica-Derived Potassium and Promote Hybrid Maize Growth
引言
钾（K）是作物生产力的三大必需常量营养元素之一，它调节酶活性、渗透平衡和光合作用，并在植物生长和胁迫耐受性（特别是在干旱条件下）中发挥关键作用。然而，全球超过20%的农业土壤缺钾，亚洲和非洲地区尤为普遍。化学钾肥的生产能耗高、分布不均且经济上不可持续。此外，土壤中大部分钾以不溶性形态存在于云母和长石等矿物中，植物难以利用。植物有效钾的比例非常小（仅0.1–0.2%），而水溶性和交换性钾合计约占1–2%。钾的固定程度受粘土矿物类型、电荷密度、水分含量、竞争离子和土壤pH值的影响。集约化农业加剧了土壤钾的耗竭，连作、地表径流、淋溶和土壤侵蚀进一步加速了钾的下降。
云母在许多农业土壤中含量丰富但钾溶解度低，是微生物动员的潜在目标。玉米（Zea mays L.）作为全球重要的谷类作物，钾需求量大，是评估解钾微生物潜力的理想系统。目前，利用能够溶解矿物结合养分的微生物已成为提高土壤钾有效性的有前景的方法。能够从矿物中释放钾的微生物提供了一种替代解决方案。解钾细菌（KSB）主要通过分泌有机酸和根系定殖来动员矿物钾，从而改善植物对钾的吸收。使用解钾细菌（KSB）是一种生物方法，可能减少农业对化学肥料的依赖。紫色非硫细菌（PNSB）是代谢多功能微生物，具有固氮、溶解磷酸盐、产生植物激素和缓解胁迫的能力。几项研究表明，接种PNSB可改善谷物和蔬菜的种子萌发、养分吸收和生长。尽管土壤中存在各种含钾矿物（包括云母），但关于解钾紫色非硫细菌对云母钾的溶解及其对玉米种子活力和幼苗发育的影响尚未得到深入研究。此外，与传统的KSB相比，对云母解钾紫色非硫细菌（MK-PNSB）的研究仍然有限。先前关于非PNSB的KSB（包括芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属和假单胞菌属）的研究表明，有机酸分泌、质子释放和螯合是钾动员的主要机制。然而，关于PNSB中这些机制的信息仍然匮乏。
因此，本研究旨在（i）从堤内冲积土中分离和鉴定云母解钾紫色非硫细菌（MK-PNSB）；（ii）评估它们对杂交玉米种子萌发和活力的影响；（iii）在水培条件下评估它们对早期幼苗生长的影响。这项工作为MK-PNSB作为可持续生物肥料候选菌株的功能潜力提供了新的见解，以增强钾有效性并促进玉米生长，同时减少对化学肥料的依赖。
材料与方法
材料
细菌来源：从安江省种植杂交玉米的堤内冲积土中分离出总共58株紫色非硫细菌（PNSB）菌株。
不溶性钾源：合成云母（K2O·3Al2O3·6SiO2·2H2O）购自中国广东华源公司，用作含钾矿物源。该材料由38–43% SiO2、10–14% Al2O3、0.15–0.3% Fe2O3、24–32% MgO、9–12% K2O、0.2–0.3% CaO和8–10% F组成。
培养基：使用基本分离培养基（BIM）培养PNSB，根据Brown的方法制备。每升蒸馏水中加入1.0 g (NH4)2SO4、0.5 g K2HPO4、0.2 g MgSO4·7H2O、2.0 g NaCl、5.0 g NaHCO3、1.5 g酵母提取物、1.5 g甘油和0.03 g L-半胱氨酸。对于固体BIM，每升BIM中再加入15 g琼脂。
方法
MK-PNSB的分离
细菌制备：将58株纯PNSB菌株在无溶性钾（无K2HPO4）、pH调至5.5的BIM液体培养基中，在微好氧光照条件（3000 lux，60 W灯泡）下预培养72小时。实验前，通过用BIM培养基稀释将培养物的光密度（OD660）标准化为0.5，以达到约105CFU mL?1的细菌密度，该密度支持最佳细菌生长。校准程序根据岛津UV-1900分光光度计的标准方案进行。每个样品连续测量三次，测量间隔为1秒。随时间重复测量被视为观测数据，而非独立的实验重复。每个处理包含三个独立的生物学重复。使用比色皿中的蒸馏水将基线设置为零。
培养基制备：液体BIM培养基（pH 5.5，无钾）在121°C、1 atm过压下高压灭菌20分钟。合成云母单独灭菌，在使用前以0.5 g L?1的浓度添加到BIM中。玻璃瓶中的蒸馏水和所有工具在相同的高压灭菌条件下灭菌。
测定在两种条件下进行：微好氧光照和好氧黑暗。BIM与细菌悬浮液的比例为90:10（v/v）。在好氧黑暗条件下，50 mL锥形管在150 rpm、30°C下培养。在微好氧光照条件下，使用12 mL玻璃试管。72小时后，将培养基在3500 rpm下离心15分钟。收集上清液，使用原子吸收光谱法（AA-7000 Shimadzu, Kyoto, Japan）在766.5 nm波长下根据Sparks等人的方法定量交换性钾含量。
细菌鉴定：将选定的菌株（M-Sl-13, M-Wa-19, M-Wa-21, M-Wa-24, M-Wa-25, M-Wa-26）在BIM（pH 5.5）中于微好氧光照条件下培养48小时。然后，将每种培养物的1.5 mL在10,000 rpm下离心5分钟以收获细胞沉淀用于DNA提取。细胞沉淀依次用70%和90%乙醇洗涤（各5分钟），再次在10,000 rpm下离心5分钟，将DNA重悬于1X TE缓冲液（ABT Vietnam, Ha Noi, Vietnam）中。使用1.0%琼脂糖凝胶电泳在紫外光下确认DNA纯度。
使用引物对8F（5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′）和1492R（5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′）通过PCR扩增16S rRNA基因。PCR条件：95°C初始变性5分钟，随后进行30个循环：95°C 30秒，55°C 30秒，72°C 2分钟，最后72°C延伸10分钟。使用TIANquick Midi纯化试剂盒纯化扩增产物，并通过1.0%琼脂糖凝胶电泳验证。DNA测序由Macrogen（Seoul, Republic of Korea）进行。使用BioEdit v7.0.5.3和ChromasPro v1.7检查序列质量，使用ClustalW比对，并使用BLASTn ver. 2.17.0与NCBI GenBank数据库进行比较。使用MEGA X通过邻接法构建系统发育树，并进行1000次 bootstrap 重复。为每个菌株获得GenBank登录号，以 Rhodoblastus acidophilus ATCC 25092 作为参考菌株， Pseudomonas monteilii strain FMZR 2 作为外群。
评估MK-PNSB对杂交玉米种子活力的影响
选定的MK-PNSB菌株在BIM（pH 5.5）中于微好氧光照条件下培养48小时。细菌细胞密度调整至105CFU mL?1（对应OD660为0.5），然后用于根据Ng等人和Jakubus与Bakinowska描述的发芽指数（GI）和活力指数（VI）评估它们对玉米萌发期间种子活力的影响。使用灭菌去离子水作为阴性对照。
杂交玉米种子表面消毒：在70%乙醇中浸泡3分钟，然后在1%次氯酸钠溶液中浸泡10分钟，最后用无菌蒸馏水彻底冲洗。然后将MK-PNSB菌株以1:1000（v/v）的比例稀释。选择1:1000的稀释率是基于初步筛选，以确保足够的细胞密度，同时最小化培养基衍生的营养影响。该稀释率也被认为对于使用液体生物肥料配方进行放大和潜在田间应用是可行的。对于六菌株混合物（6-MIX），将每种菌株的0.2 mL混合形成1 mL接种物。
实验包括四个重复，每个重复由一个培养皿组成，内含10粒玉米种子，置于两层湿纸之间。向每个培养皿中加入5 mL稀释的细菌悬浮液（或用于对照的无菌水）。培养皿在30°C下培养5天。培养后，使用直尺（毫米刻度）测量发芽率、芽高（从种子到芽尖）和根长（从种子到根尖）。
根据Sparks等人和Jakubus & Bakinowska的方法，在120小时后计算种子发芽百分比和幼苗生长参数。使用的公式为：
RSG（相对种子发芽率，%）= [细菌处理中发芽种子数（B）/ 蒸馏水对照中发芽种子数（DW）] × 100
RRG（相对根生长，%）= [细菌处理平均根长（RB）/ 对照平均根长（RDW）] × 100
GI（发芽指数）= (RSG × RRG) / 100
早期幼苗活力评估如下：
GR（发芽率）= [（总种子数 - 未发芽种子数）/ 总种子数] × 100
VI（活力指数）= [（SB+ RB）/（SDW+ RDW）] × GR (%)
IVI（改进活力指数）(%）= [（VIB? VIDW）/ VIDW] × 100
评估MK-PNSB对杂交玉米幼苗早期生长的影响
本实验旨在评估含有MK-PNSB的液体微生物制剂在静态水培条件下对杂交玉米幼苗早期生长和生物量的影响。具体来说，植物在含有NPK营养和细菌悬浮液（根据处理）的营养液中生长。光/暗周期分别为14小时和10小时，湿度为58%。水培实验的营养液通过溶解1.143 g硝酸铵（NH4NO3）、1.212 g硝酸钠（NaNO3）、4.057 g七水合硫酸镁（MgSO4·7H2O）、2.941 g二水合氯化钙（CaCl2·2H2O）和1.337 g硫酸钾（K2SO4）制备。使用静态水培条件以消除土壤对根系发育的影响。静态水培系统由一个容器组成，尺寸为顶部直径117毫米，底部直径85毫米，高度152毫米。盖子设计有三个开口，每个开口配有海绵插入物以支撑种子并保持水分。
实验设计：采用完全随机设计（CRD），包含八个处理和每个处理四个重复。每个重复包括四个盆，每个盆包含三株玉米幼苗。处理包括：对照（不接种细菌）；M-Sl-13（接种M-Sl-13）；M-Wa-19（接种M-Wa-19）；M-Wa-21（接种M-Wa-21）；M-Wa-24（接种M-Wa-24）；M-Wa-25（接种M-Wa-25）；M-Wa-26（接种M-Wa-26）；以及6-MIX（所有六种MK-PNSB菌株的混合物）。
种子处理：杂交玉米种子（品种DK6919S）用1%次氯酸钠和乙醇表面消毒，用去离子水冲洗，并在黑暗中预发芽24小时。然后将发芽的种子在播种前浸泡在10 mL相应处理的MK-PNSB悬浮液（1 × 109CFU mL?1）中一小时。以每盆三粒种子的密度播种。
生长参数：播种后15天，从每盆三株植物记录以下参数：株高（cm）：从基部到最高叶尖测量；叶片数（计数）：每株植物完全展开叶片的总数；叶长（cm）：从叶基部到最上部叶尖的距离；叶宽（cm）：在最上部成熟叶的最宽点测量；初生根数（计数）：每株植物主根的数量；根长（cm）：从根茎交界处到根尖的距离；以及根干重（g）：收获根部，在70°C下烘箱干燥48小时，然后称重。
统计分析
所有数据均使用Microsoft Excel 2016处理。所有数据均检查正态分布。本文中呈现的数据除非另有说明，均为三次重复的平均值。评估种子活力增强的实验和评估PNSB对玉米幼苗生长影响的水培实验均进行了四次重复。通过单向方差分析（ANOVA）比较不同MK-PNSB处理间的平均值。消除了气候的干扰因素，重复显示出同质标准。使用SPSS软件版本13.0应用Duncan多重范围检验确定5%水平上的显著性差异。
结果
基于从云母中溶解钾的能力从堤内冲积土中筛选MK-PNSB
测试的58株紫色非硫细菌（PNSB）菌株在含有不溶性钾（合成云母）的BIM培养基中，在微好氧光照和好氧黑暗两种条件下培养72小时后，均表现出解钾能力。排除了8株溶解能力低（<0.1 mg?L?1）的菌株。
在微好氧光照条件下，PNSB菌株的钾溶解能力范围为0.40至27.4 mg?L?1。菌株M-Wa-19表现出最高的溶解水平。相反，M-Wa-05、M-Wa-30、M-Sl-09和M-So-21等菌株活性较低，钾浓度仅为0.400–0.867 mg?L?1。
在好氧黑暗条件下，溶解的钾浓度范围为0.60至21.0 mg?L?1。M-Wa-24和M-Wa-26达到最高水平（分别为21.0和20.1 mg?L?1），而菌株M-So-10、M-So-14、M-Sl-02、M-Sl-19和M-So-09显示出较低的钾释放（0.600–0.867 mg?L?1）。
三株MK-PNSB菌株——M-Wa-21、M-Wa-25和M-Sl-13——在两种条件下均有效。它们在微好氧光照和好氧黑暗条件下分别溶解了23.2和14.3 mg?L?1、25.1和13.6 mg?L?1以及24.4和12.9 mg?L?1的钾。
基于从云母中溶解钾的能力鉴定堤内冲积土中的MK-PNSB
通过16S rRNA基因序列鉴定，六株细菌菌株M-Sl-13、M-Wa-19、M-Wa-21、M-Wa-24、M-Wa-25和M-Wa-26分别与 Rhodopseudomonas palustris (PX588604)、 Rhodoplanes pokkaliisoli (PX588605)、 Afifella marina 菌株 (PX588606)、 Rhodocista pekingensis (PX588607)、 Rhodocista pekingensis 菌株 (PX588608) 和 Rhodocista pekingensis (PX588609) 相同。
MK-PNSB增强杂交玉米种子活力的能力
用六种单独的MK-PNSB菌株（M-Sl-13、M-Wa-19、M-Wa-21、M-Wa-24、M-Wa-25、M-Wa-26）和6-MIX处理的玉米幼苗的根长范围为2.41至3.92 cm，均超过对照值2.25 cm。芽高范围为3.12至3.99 cm，而对照为3.04 cm。所有处理均促进了根和芽的伸长。
用MK-PNSB菌株（M-Sl-13、M-Wa-19、M-Wa-21、M-Wa-24、M-Wa-25、M-Wa-26）和6-MIX处理的种子发芽率范围为80%至100%，高于对照的75%。M-Wa-21、M-Wa-24和6-MIX记录到最高发芽率（100%），表明具有强烈的促发芽作用。
活力指数（VI）在MK-PNSB菌株和6-MIX之间存在5%水平上的显著差异。所有处理的VI值均高于对照（3.96%），范围从4.43%到7.91%。M-Wa-19（7.39%）、M-Wa-21（7.91%）和6-MIX（7.19%）记录到最高值。
发芽指数（GI）从114.5%变化到232.5%。M-Wa-25在处理过的种子中显示出最低的GI（114.5%），而M-Wa-21达到最高（232.5%）。6-MIX的GI达到208.0%，也显著高于对照。
改进活力指数（IVI）在各处理中范围从11.8%到99.7%。菌株M-Wa-21显示出最显著的效果（比对照增加99.7%），其次是6-MIX（81.4%）。
MK-PNSB对杂交玉米幼苗早期生长的影响
施用单独的MK-PNSB菌株（M-Sl-13、M-Wa-19、M-Wa-21、M-Wa-24、M-Wa-25、M-Wa-26）和6-MIX，在水培条件下显著改善了杂交玉米幼苗的早期生长特性，与未接种对照相比。处理过的幼苗表现出增加的株高（25.0–26.5 cm）、叶片数（3.92–4.00 片/株）、叶宽（1.32–1.39 cm）和根干生物量（0.135–0.145 g/株），均超过对照值（分别为21.0 cm、3.38片、1.10 cm和0.118 g/株）。值得注意的是，M-Wa-26产生最大的叶长（21.1 cm）和根长（16.4 cm），而6-MIX也表现出改善（分别为18.7 cm和14.4 cm）。在所有处理中，M-Wa-21导致最高的初生根数（9.33 根/株），而对照组在叶长（1.10 cm）、根数（7.06根）和根长（12.1 cm）方面记录到最低值。这些发现证实了MK-PNSB菌株在促进玉米早期营养发育方面的潜力。
讨论
MK-PNSB的钾溶解
MK-PNSB菌株在微好氧光照和好氧黑暗两种条件下从合成云母中表现出广泛的解钾能力。Thu等人先前从堤内冲积土中鉴定出三株菌株， Cereibacter sphaeroides M-Sl-09、 Rhodopseudomonas thermotolerans M-So-11 和 Rhodopseudomonas palustris M-So-14，能够溶解钾，其中M-So-11显示出最高活性（好氧黑暗下48.8 mg?L?1，微好氧光照下49.7 mg?L?1）。类似地，从酸性硫酸盐水稻土中分离的 Rhodopseudomonas pentothenatexigen AC04.1 在好氧黑暗和微好氧光照条件下分别溶解了17.7 mg?L?1和24.3 mg?L?1的钾，表明PNSB可以在不同土壤类型中有效动员矿物钾。
观察到的溶解能力（高达27.4 mg?L?1）处于其他微生物KSB报告的范围内。其他KSB也表现出显著的性能。例如， Agrobacterium tumefaciens OPVS 1溶解了16.2和49.73 μg?mL?1的钾，而 Bacillus mucilaginosus MCRCp1 从白云母中释放了高达4.29 mg?L?1的钾。来自始成土和老成土的分离物KI16和KA59分别溶解了23.88和13.71 μg?mL?1的钾。类似地，菌株PSB-40和PSB-56从白云母中分别溶解了6.1和6.5 μg?mL?1的钾，而菌株如 Pantoea ananatis、 Enterobacter sp. 和 Raoultella aquatilis 分别从云母中释放了38.9、33.6和15.5 μg?mL?1的钾。MK-PNSB溶解钾的能力可能归因于有机酸、胞外多糖和螯合化合物的分泌，这些物质削弱了矿物晶格并释放出结合的钾。此外，胞外多糖（EPS）可以通过形成生物膜将质子保留在矿物表面附近来增强矿物溶解，而铁载体可以动员相关的Fe和Al离子，进一步破坏基质稳定性。总之，MK-PNSB的钾溶解可能与有机酸产生、pH降低、螯合和/或胞外多糖分泌有关，正如其他KSB所报道的那样。这些机制应在未来的研究中加以量化。然而，与其他KSB不同，MK-PNSB在微好氧和好氧条件下均能发挥作用的能力也反映了 Rhodopseudomonas spp. 的代谢多功能性，它们可以在光养和化学异养代谢之间切换。
生长促进的潜在机制
菌株M-Wa-19、M-Wa-21和6-MIX显著提高了发芽率和发芽指数。混合菌群（6-MIX）的优越性能表明了功能互补性，其中不同的菌株贡献不同的溶解途径或促生长特性。这些结果与先前显示有益细菌可以增强玉米种子萌发的研究一致。例如，Noumavo等人报道，用 P. fluorescens + P. putida 处理的玉米发芽率达到100%，用 A. lipoferum 处理达到98.33%。此外，与 P. fluorescens 和 P. putida 共同接种使幼苗活力比对照提高了77.54%。一组PGPR也改善了玉米发芽。已知PNSB能产生吲哚-3-乙酸（IAA）、溶解磷酸盐并具有ACC脱氨酶活性，共同增强根系生长、养分可用性和胁迫耐受性。然而，我们的结果基于相对较小的样本量和短期测定，因此应被视为初步结果。
在水培系统中，所有测试的MK-PNSB菌株M-Sl-13、M-Wa-19、M-Wa
