《Applied Microbiology》：Extensive Molecular Characterization of a New Bacterial Cellulose Hydrogel (BCH) Producing Gluconacetobacter Isolate from Nigeria-Sourced Agro-Residue
Abstract
细菌纤维素水凝胶（BCHs）被表征为由细菌合成的、由具有不同聚合度的β-1-4-糖苷键连接的葡萄糖聚合物组成的胞外多糖。关于从尼日利亚分离和鉴定BCH生产者菌株的信息很少。因此，本研究旨在表征一株先前已被证实能产生BCH的新醋酸杆菌（Acetobacter）物种。通过PCR扩增全长16S rRNA基因以及全基因组测序分析对BCH生产菌株进行了表征。使用Illumina下一代测序（NGS）平台测定菌株的全基因组序列，并通过metaWRAP流程对基因组读段进行下游分析。基于与参考菌株东方葡糖酸杆菌（Acetobacter orientalis）VVS的序列一致性，该BCH生产者被鉴定为东方葡糖酸杆菌（Acetobacter orientalis）Zaria-B1菌株。根据其注释的基因组，该分离株的基因组大小约为3.1 Mbp，含有45个总RNA，GC含量为52.5%，3046个蛋白质编码基因，N50为253,774 bp，L50为4，以及30个重叠群。纤维素合酶基因序列的核苷酸BLAST确认该基因组箱（bin）为东方葡糖酸杆菌（Acetobacter orientalis）。全基因组表征以及16S rRNA基因分型共同证实了该BCH生产菌株为东方葡糖酸杆菌（Acetobacter orientalis）。
1. Introduction
纤维素是生物圈中最常见的可再生生物聚合物（均聚多糖）（C6H10O5），主要由通过β（1-4）糖苷键连接的葡萄糖单体组成。它由微生物、动物和植物产生。细菌纤维素水凝胶（BCH）是天然细菌纤维素的三维（3-D）网络结构，能够吸收和保留大量水分。与植物纤维素耗能且不环保的纯化过程相比，细菌纤维素（BC）在发酵过程中产生的污染物较少。BCH具有良好的机械性能，使其成为复合材料中增强剂的理想生物资源。BCH不含木质素、半纤维素、果胶、蜡质等难以去除的植物杂质。
BCH由于其纳米纤维的生物相容性和高持水能力，适用于创面敷料材料的开发。这种生物材料因其三维纳米结构、独特的物理、机械和热性能以及高纯度等理想特性，已被商业化用于健康、食品、高强度纸张、扬声器、过滤膜、伤口敷料材料、人造血管和其他生物医学设备。
细菌纤维素合成操纵子（bcsABCD）编码负责纤维素聚合和输出的核心酶。葡糖酸杆菌（Gluconacetobacter）物种使用涉及不同酶、催化复合物和调控蛋白的多步代谢途径进行纤维素生产。假设葡萄糖为碳源，其生物合成途径包括四个主要酶促步骤：（i）葡萄糖激酶磷酸化葡萄糖；（ii）磷酸葡萄糖变位酶将葡萄糖-6-磷酸（Glc-6-P）异构化为葡萄糖-1-磷酸（Glc-1-P）；（iii）UDPG焦磷酸化酶（UGPase）合成UDP-葡萄糖（UDPGlc）；（iv）纤维素合酶反应。在所有葡糖酸杆菌（Gluconacetobacter）物种和其他BCH生产细菌物种中，细菌纤维素合成（bcs）操纵子编码纤维素的合成。该操纵子有四个亚基（bcsA, bcsB, bcsC, bcsD），这些亚基对于完整的BCH合成是必需的。纤维素合酶的催化亚基由bcsABCD操纵子的第一个基因bcsA编码。纤维素合酶的调节亚基由第二个基因bcsB编码，它结合启动纤维素合成过程的第二信使环二鸟苷酸单磷酸（c-di-GMP）。
醋酸杆菌（AAB）是属于α-变形菌纲（Alphapteobacteria）醋酸杆菌科（Acetobacteraceae）的一类细菌，包含14个属。由于其能够从多种碳源和氮源在液体培养中产生相对大量的BCH，木葡糖酸杆菌（Gluconacetobacter xylinus）（以前称为木醋杆菌Acetobacter xylinum）是研究最深入的物种之一。尽管对细菌BCH生产者进行了广泛研究，但在尼日利亚尚未有分离或鉴定的报道。此外，文献中尚未有东方醋酸杆菌（Acetobacter orientalis）物种产生BCH的报道。因此，寻找其他能够产生BCH的醋酸杆菌（葡糖酸杆菌Gluconacetobacter）物种变得十分必要。因此，本研究旨在表征从香蕉皮农业废弃物中纯化的一株新型BCH生产细菌分离株。全基因组测序数据将为研究生物提供全面的分类学信息，因为桑格测序法的基因分型可能因与参考序列的一致性指数较低而受到限制，难以鉴定到物种或菌株水平。此外，对本地葡糖酸杆菌（Gluconacetobacter）菌株进行完整的基因组测序分析，以及纤维素合成操纵子（acs操纵子）中亚基基因的表征，将提供基因组数据，为理解和修改细菌纤维素合酶（bcs）基因的表型以进一步提高BCH产量提供可行的平台。
分子鉴定技术已经彻底改变了细菌鉴定研究，能够快速准确地鉴定特定物种。DNA测序方法有许多应用，包括细菌物种鉴定和抗生素耐药性基因传播的追踪。这些方法的例子包括桑格测序、NGS和第三代测序。全基因组测序（WGS）是用于确定生物体完整DNA序列的一种方法。该方法使用高通量测序在短时间内产生大量数据。WGS涉及的步骤包括DNA提取、文库制备、测序和生物信息学分析。
BLAST（基本局部比对搜索工具）通过研究人员提供的查询序列（DNA或蛋白质序列）与NCBI数据库中的生物序列库进行比较，以识别最相似的生物序列。BLAST是一种用于双序列（核苷酸或蛋白质）比对的算法或软件。MetaWRAP是一种直观的模块化流程，可自动执行宏基因组分析中的核心任务，极大地增强了高质量宏基因组基因组箱的提取和解释。现代软件使用metaWRAP管理宏基因组数据处理，从原始测序读段开始，到宏基因组基因组箱及其分析结束。本研究使用BLASTn进行搜索。
2. Materials and Methods
2.1. Retrieval and Culturing of the BCH-Producing Isolate on Hestrin–Schrann (HS) Media
细菌分离株来自一项初步研究，该研究使用所述方法从香蕉皮农业废弃物中分离，随后使用Hestrin–Schramm（HS）培养基（肉汤和琼脂）筛选BCH生产能力。将10 mL细菌培养物接种到90 mL肉汤培养基中，在30°C、150 rpm的摇床培养箱中培养48小时。所得培养物用于基因组DNA提取。对于琼脂平板，将100 μL分离株的前培养物接种到无菌琼脂平板中，并用无菌接种环涂布器铺开。平板在30°C下培养48小时，观察菌落生长。从每个平板随机挑取菌落用于基因组DNA提取。
2.2. Genomic DNA Extraction from Broth and Agar Cultures
DNA提取前，从每个锥形瓶中将200 μL肉汤培养物等分到1.5 mL微量离心管中。对于琼脂平板的DNA提取，使用P100移液器吸头将随机从琼脂平板挑取的细菌菌落 scoop 放入含有200 μL DNA洗脱缓冲液的1.5 mL Eppendorf管中。涡旋混合后，使用Zymo Research Quick-DNATMMiniprep Plus Kit按照制造商说明提取基因组DNA。纯化的DNA在50 μL洗脱缓冲液中洗脱。使用NanoDrop分光光度计测定提取DNA的质量和浓度。
2.3. Polymerase Chain Reaction (PCR) Amplification of the 16S rRNA Gene
使用提取的细菌DNA，通过通用正向引物48A和反向引物48B PCR扩增长度完整的16S rRNA基因。PCR反应总体积为25 μL。使用的PCR循环条件包括：94°C初始变性5分钟；94°C变性30秒、48°C退火1分钟、68°C延伸1分钟，共35个循环；68°C最终延伸10分钟；4°C保存。PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳分析。
2.4. Sequencing and Bioinformatics Analysis of PCR Amplicons
PCR扩增产物通过染料终止法（桑格法）在AB1 XL3500遗传分析仪上进行测序。使用BioEdit序列比对编辑器v7.2.5编辑测序数据中的模糊核苷酸代码。编辑后的反向序列使用"反向互补功能"进行反向互补。然后，使用程序的"双序列比对功能"比对正向和反向序列。最后，使用程序的"创建一致性序列算法"生成代表两个比对序列的一致性核苷酸序列。
生成的一致性序列提交至NCBI核苷酸BLAST，根据最高的查询覆盖率和百分比一致性指数以及最低的E值，选择10个BLAST命中序列，以FASTA格式下载。使用MEGA11软件上的ClustalW进行多序列比对（MSA）。采用最大似然法和Tamura-Nei模型推断进化历史。系统发育树设置1000次重复的自举值。使用Fig Tree软件v1.4.4进一步编辑系统发育树。将鉴定出的分离株的16S rRNA基因一致性序列提交至NCBI GenBank数据库并获得登录号。
2.5. Whole-Genome Sequencing of the Isolate
将纯化的细菌分离株DNA送去进行全基因组测序分析。文库制备过程如下：使用NEB Ultra II FS试剂盒通过酶学法片段化基因组DNA。使用AMPure XP珠子对产生的DNA片段进行大小选择（200–700 bp），对片段进行末端修复，并将Illumina特异性接头序列连接到每个片段上。每个样本单独索引，并进行第二次大小选择步骤。然后使用荧光法对样本进行定量。将样本稀释至标准浓度（4 nM），然后使用NextSeq中输出试剂盒（300个循环）在Illumina NextSeq500平台上进行测序，遵循制造商描述的标准方案。为每个样本产生2 × 150 bp的双末端测序数据。
2.6. Data Analysis of the Whole-Genome Sequence (WGS) Reads Using the metaWRAP Pipeline Modules
MetaWRAP是一个开源且易于使用的模块化流程，可自动化基因组分析的核心任务。下载基因组读段后，运行metaWRAP-Read_qc模块来修剪读段并使用"bmtagger hg38"去除人源污染。然后使用metaWRAP-Assembly模块，通过"metaSPADES或MegaHIT"程序（版本3.15.5）组装读段。在连接样本读段后执行此操作。为了了解群落（读段）的分类组成，使用"Kraken"模块对读段和组装结果进行分析。组装后，使用metaWRAP-Binning模块通过三种不同的算法（CONCOCT, MaxBin, MetaBAT）对共同组装结果进行分箱。
接下来，使用metaWRAP Bin-Refinement模块将CONCOCT、MaxBin和MetaBAT的基因组箱集合合并成一个更强大的基因组箱集合。此模块使用CheckM数据库。程序默认设置了70%的最小完整度和5%的最大污染度。使用Blobology模块可视化群落（合并的基因组箱集合）和提取的基因组箱。该模块用于将整个组装结果投影到GC含量与丰度的平面上，并用分类信息和分箱信息进行注释。此后，使用Quant模块确定草稿基因组（基因组箱）在样本中的丰度。接下来，使用Reassemble-bins模块重新组装合并的基因组箱集合。
Reassemble-bins模块收集属于每个基因组箱的读段，然后分别使用"宽松"和"严格"算法重新组装它们。只有通过重新组装得到改进的基因组箱才会在最终集合中被修改。此后，使用Classify-bins模块和Taxator-tk程序推断每个基因组箱的分类学。对于此模块，使用NCBI_nt和NCBI_tax数据库。Classify_bins模块使用Taxator-tk准确分配每个重叠群的分类学，然后合并结果以估计整个基因组箱的分类学。
MetaWRAP流程的另一个重要模块是"CLASSIFY_Bin Module"，用于为分析的基因组箱分配分类层级。首先，将所有基因组箱中的重叠群合并到一个文件中，并使用blastn v2.7.1将重叠群与NCBI_nt数据库进行比对。然后，比对结果被taxator-kt v1.3.3e用来估计每个重叠群的分类学。然后从单个重叠群的预测中估计每个基因组箱最可能的分类学。一旦无法估计进一步的分类等级，就报告基因组箱的最终分类学。
毫无疑问，预测的成功和准确性在很大程度上取决于现有数据库的查询覆盖率和百分比序列一致性指数。最后，使用Annotate-bins模块和RAST（使用子系统技术的快速注释）在线工具对生成的基因组箱进行功能注释。注释后的基因组箱然后在SEED查看器在线工具上可视化。
3. Results
3.1. Molecular Identification of the BCH-Producing Isolate by the Full-Length 16S rRNA Gene
3.1.1. Genomic DNA Extraction and Quantification
提取的基因组DNA浓度记录在基因组DNA的标准范围（5–100 ng/μL）内，纯度水平（A260/A280比率）也在预期的1.80左右。在提取的DNA样本中，只有来自PLT2的PCR扩增产物通过了测序质量检查（QC）；该扩增产物被成功测序并用于下游分析。此外，相同的基因组材料也进行了全基因组测序。
3.1.2. Gel Electrophoresis of the 16S rRNA PCR Amplicons
根据NanoDrop质量检查，选择了四个提取的基因组DNA用于全长16S rRNA基因的PCR扩增，结合使用琼脂和肉汤培养物。三个测试的DNA被成功扩增。从凝胶电泳图可以看出，扩增产物PLT2具有最清晰的 distinct 条带，因此通过了测序QC。尽管如此，扩增产物PLT1和BRT1也具有一些 distinct 条带，并且都在相同的大小（1.5 kbp）下被扩增。
3.1.3. Nucleotide BLAST Output with Parameters of the Sequenced 16S rRNA Gene
使用BioEdit序列比对编辑器v7.2.5分析和比对PCR扩增产物的序列。从BLAST算法输出中，返回了醋酸杆菌属（Acetobacter）的不同物种，包括orientalis, tropicalis, persici, pasteurianus, cibinongensis, indonesiensis, malorum, cerevisiae。然而，orientalis物种构成了大部分命中。根据BLAST输出，第一个命中，来自印度的东方醋酸杆菌（Acetobacter orientalis）菌株VVS，具有最高的百分比一致性96.68%，E值为0.0，查询覆盖率为98%；这些参数与第二个参考序列未培养的醋酸杆菌（Acetobacter）sp. 分离株DGGE共享，尽管从该分析中无法获得第二个参考序列的进一步详细信息。
3.1.4. Evolutionary Relatedness (Phylogeny) of the BCH-Producing Isolate
从分离株的16S rRNA基因序列的BLAST输出及其在系统发育树上的相对位置预测了其进化相关性和祖先。这一发现使得能够准确预测研究生物的属和物种身份。此外，为分离株和其他参考醋酸杆菌物种构建的系统发育树将查询序列与参考东方醋酸杆菌（Acetobacter orientalis）菌株VVS置于同一进化枝中。这明显表明该分离株与参考物种亲缘关系最近。基于与该参考物种共享的百分比一致性以及从其系统发育位置预测的进化相关性，该BCH生产分离株在此被鉴定为东方醋酸杆菌（Acetobacter orientalis）。
3.2. Whole-Genome Characterization of the Acetobacter Orientalis Zaria-B1
3.2.1. Completion and Contamination Indexes of Reassembled Bin
为了准确评估重新组装模块，使用了三个重要指标：N50、完整度和污染度。N50统计量从连续性方面定义组装质量。N50定义为总组装长度50%处的最短重叠群的长度。基于图表，重新组装的基因组箱的N50为253,774 bp。预期的最小基因组箱完整度（-C）设置为70%，并且如图表b中的红色曲线所示，基因组箱完整度约为100%。而预期的最大污染率（-X）范围为5%至10%，返回的污染率约为0.7%。这三个指标清楚地表明重新组装模块是成功的。
3.2.2. Hierarchical Taxonomic Classification of Bin from the metaWRAP Classify-Bin Module
报告的最终分类学呈现在聚类热图上。图表显示，大多数散点被标记为蓝色，对应于细菌的超界（域）分类学；此等级中的其他群是真核生物（红色）。图表也显示大多数点被标记为蓝色，对应于变形菌门（Proteobacteria）的分类学；此等级中的其他分类群是节肢动物门（红色）和厚壁菌门（Firmicutes）（黄色）。图表给出了类似的结果，其中超过95%的点（对应于不同的重叠群）被标记为蓝色；在这种情况下，蓝色代表红螺菌目（Rhodospirillales）的分类学，此等级中的其他分类群是鞘脂单胞菌目（Sphingomonadales）（红色）。此外，在每次分类分配中，蓝色点也具有最高的重叠群丰度。总之，在上述三个图表中观察到的模式将研究分离株分类到域：细菌；门：变形菌门；目：红螺菌目。
3.2.3. Genome Annotation Using the metaWRAP Annotate_Bin Module
通过metaWRAP "Annotate_BINS模块"，使用RAST和SEED Viewer在线工具实现了组装基因组的注释。根据注释，分离株的基因组大小为3,084,067 bp（3.1 Mbp），具有以下特性：GC含量为52.5%；N50 = 253,774 bp；L50 = 4；重叠群数量 = 30；编码序列数量 = 3047；RNA数量 = 45。图表显示了来自注释基因组的东方醋酸杆菌（Acetobacter orientalis）Zaria-B1分离株的代谢取向。该图显示了与子系统相关的基因及其类别分布。这些是分离株的一些预测代谢，连同它们各自数量的蛋白质编码基因（PEGs）显示在括号中，这些基因转化为参与每个代谢途径的基因产物。根据其注释的基因组，预测东方醋酸杆菌（Acetobacter orientalis）Zaria-B1表现出初级和次级代谢。
此外，使用RAST进行的基因组注释也呈现了分离株的分类学概况如下：细菌（Bacteria）；假单胞菌门（Pseudomonadati）；假单胞菌门（Pseudomonadota）；α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）；醋酸杆菌目（Acetobacterales）；醋酸杆菌科（Acetobacteraceae）；醋酸杆菌属（Acetobacter）；东方醋酸杆菌（Acetobacter orientalis）；东方醋酸杆菌（Acetobacter orientalis）Zaria-B1。
3.2.4. NCBI Nucleotide BLAST of the Cellulose Synthase Gene
来自分离株Zaria-B1的基因组箱的层级分类学都与NCBI GenBank在其16S rRNA基因序列提交到数据库后分配的类别一致。然而，系统无法在此分类级别之外进行识别，并且根据开发人员的说明，建议使用来自注释基因组的目标生物的一个保守的分类标记基因序列进行核苷酸BLAST以进行物种鉴定。因此，使用纤维素合酶催化亚基基因进行BLAST。查询基因序列的BLAST输出仅返回一个命中，该命中属于东方醋酸杆菌（Acetobacter orientalis）菌株FAN1，百分比一致性为98.44%，查询覆盖率为100%。这明显证实了组装的基因组属于东方醋酸杆菌（Acetobacter orientalis），这是对先前16S rRNA鉴定的补充。纤维素合酶的基因序列是编码序列，其序列两端有起始密码子ATG和终止密码子TAG。bcs基因序列长度为4608 bp，氨基酸序列长度为1536 aa。在全基因组表征之后，将分离株的纤维素合酶催化亚基基因和β-1,4-内切葡聚糖酶基因序列提交至NCBI GenBank数据库，并分配了登录号PP393681和PP393682。这两个基因的产物对于细菌纤维素水凝胶（BCH）的功能性合成至关重要。
4. Discussion
BCH的超纯和纳米纤维结构使其区别于植物纤维素。BCH以其强度、柔韧性和高持水能力（可达其重量的约90%）而闻名。因此，BCH引起广泛关注，并且已经采用了多种方法进行该生物材料的研究和开发，这并不令人惊讶。
微生物的分子表征已成为补充其他初步表征（如显微、形态和生化）的必要手段，这些初步表征不够灵敏，无法确定目标生物的物种和菌株。在本研究中，使用分子技术通过PCR扩增细菌16S rRNA基因和测序来表征一株新的BCH生产分离株，鉴定为东方醋酸杆菌（Acetobacter orientalis）。本研究的结果与几项其他研究相似，这些研究使用类似技术报道了醋酸杆菌科（Acetobacteraceae）几个物种的表征。例如，参考文献[24]从马来西亚的腐烂水果中分离并表征了一株细菌纳米纤维素（BNC）生产者，鉴定为木葡糖酸杆菌（Gluconacetobacter xylinus）；东方醋酸杆菌（Acetobacter orientalis）物种从印度尼西亚的花卉、水果和发酵食品中分离出来，并被鉴定为orientalis物种[25]。类似地，参考文献[26,27,28]也从布基纳法索的芒果发酵汁中分离出热带醋酸杆菌（Acetobacter tropicalis），能够生产醋，以及从中国海洋软珊瑚中分离出具有纤维素分解和木质素分解能力的细菌东方醋酸杆菌（Acetobacter orientalis）XJC-C，并将它们鉴定为同一物种。所有引用的研究都采用了细菌16S rRNA基因的PCR扩增[29]、测序和系统发育树的构建来确定生物的属和物种。在这些研究中，扩增的16S rRNA基因扩增产物的核苷酸大小范围从1.3到1.5 kbp。
N50是一个从连续性方面定义组装质量的统计指标。由于在计算N50时重叠群是按长度排序的，因此可以说L50就是输出N50长度的重叠群的排名[21]。用于评估基因组箱质量的另外两个参数是完整度和污染度。从图中估计，基因组箱的完整度约为100%，而污染度被发现为0.7%。完整度是指在组装和重新组装过程中对种群基因组的覆盖水平，而污染度是来自另一个基因组的、不属于该种群的序列量[21]。在metaWRAP重新组装模块中，预期的最小完整度为50–70%，而最大污染度为5–10%。这两个指标通常通过计数每个基因组箱内的通用单拷贝基因来估计。在基因组箱中发现的预期单拷贝基因的百分比被解释为其完整度，而污染度则是根据发现重复的单拷贝基因的百分比计算的[21]。
从研究生物的注释基因组中获得的结果与许多其他作者的工作显示出相似性和差异性[8,11,14,23]。这种比较分析在补充表S1中呈现。基因组数据提供了BCH生产分离株到物种水平的分类学概况。注释基因组的一个有趣报告是关于纤维素合酶催化亚基基因，包含bcsA和bcsB亚基，DNA大小为4611 bp，编码1537个氨基酸残基[30]。从注释中看到的bcs亚基基因的另一个组成部分是编码β-1,4-葡聚糖酶的bcsC，长度为1080 bp，编码360个氨基酸残基[31]。bcsC亚基作为bcs基因的调节组分，其功能是将尿苷二磷酸（UDP）结合到催化亚基bcsA上。上述
