《Bioactive Materials》：LRP-1/CD44-targeted regorafenib nano-delivery system leveraging anti-angiogenesis and synergistic cytotoxicity against peritoneal metastasis of colorectal cancer
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本研究针对结直肠癌腹膜转移(PM-CRC)治疗中瑞戈非尼(REG)溶解性差、生物利用度低等瓶颈，开发了乳铁蛋白(LF)和透明质酸(HA)修饰的双靶向纳米平台REG@LFHA NPs。该体系通过LRP-1/CD44受体介导的靶向作用，显著增强肿瘤蓄积，并协同奥沙利铂(OxP)通过抑制VEGF-VEGFR通路、诱导肿瘤细胞凋亡/周期阻滞、重编程M2型巨噬细胞向M1型极化等多重机制，显著抑制PM-CRC进展，为临床联合治疗提供了新策略。
结直肠癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，其不良临床结局主要归因于肿瘤的转移性扩散。其中，腹膜转移(PM)在晚期结直肠癌患者中的发生率高达20-25%，并且预示着极差的预后，其5年生存率持续低于15%。这些严峻的临床现实凸显了开发更有效治疗方法的迫切性。腹膜转移性结直肠癌(PM-CRC)的发病机制涉及肿瘤细胞与其微环境之间复杂的相互作用。一个关键的病理特征是异常血管网络的形成，该网络不仅通过营养供应维持肿瘤生长，还促进了转移性播散。这种失调的血管生成了一个自我强化的循环，促进了局部进展和腹膜种植。
面对这一挑战，抗血管生成治疗已成为PM-CRC的重要策略。以贝伐珠单抗、雷莫西尤单抗和阿柏西普为代表的血管内皮生长因子/血管内皮生长因子受体(VEGF/VEGFR)通路抑制剂已在临床应用中显示出疗效。在此背景下，口服多靶点抑制剂瑞戈非尼(REG)因其独特的作用机制而受到广泛关注。该药物不仅能有效阻断VEGF/VEGFR信号通路，还能同时靶向多个参与肿瘤进展的激酶受体，展现出显著的多靶点抗肿瘤特性。从其作用机制来看，REG通过多种途径发挥抗肿瘤作用：其强大的抗血管生成作用显著破坏了肿瘤的血氧供应，同时该药物还能直接诱导肿瘤细胞凋亡和细胞周期阻滞。此外，近期研究还揭示REG具有独特的免疫调节功能，能够将免疫抑制性的M2型巨噬细胞重编程为具有肿瘤杀伤能力的M1表型，从而重塑肿瘤免疫微环境。
然而，尽管REG具有广谱抗肿瘤活性，但其治疗效果受到溶解性差和渗透性低的显著限制，这共同损害了其全身生物利用度和肿瘤药物蓄积。此外，药物的脱靶分布会诱发剂量限制性毒性，如手足综合征，从而导致需要减量或停药，限制了其临床适用性。虽然腹腔给药部分规避了首过效应并增强了局部药物暴露，但由于腹膜清除快和肿瘤穿透效率低，这种方法仍不理想，最终往往无法在靶点达到治疗药物浓度。
为了克服这些挑战，纳米技术在提高各种常规化疗和靶向药物的递送效率方面展现出巨大潜力。识别和利用关键受体是实现精准靶向递送从而改善治疗效果的关键策略。基于肿瘤细胞和各种肿瘤微环境(TME)成分中低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP-1)、CD44、CD206和整合素αvβ3等受体的特征性过表达，研究人员开发了多种纳米平台，显著提高了瘤内药物递送效率。
本研究基于上述理论，开发了一种创新的LF-HA杂化纳米平台(REG@LFHA NPs)用于递送REG。该平台通过合理整合LF的载药能力及其与HA固有的静电相互作用构建而成。合理设计的纳米系统结合了两种组分的互补生物学功能：LF组分通过LRP-1识别介导肿瘤靶向递送，并通过巨噬细胞极化有效缓解免疫抑制性TME；而HA涂层则通过CD44受体介导的主动靶向增强肿瘤蓄积。为了进一步提升REG的治疗效果并促进其临床转化，我们系统评估了该纳米系统与一线临床药物奥沙利铂(OxP)的联合治疗效果。
为开展本研究，研究人员主要应用了以下关键技术方法：利用纳米沉淀法和静电自组装技术构建并表征了REG@LFHA NPs；通过细胞实验（包括CCK-8法、流式细胞术、细胞周期与凋亡检测、血管生成实验等）评估了纳米颗粒的细胞摄取、体外抗肿瘤活性、抗血管生成作用及对巨噬细胞极化的免疫调节效应；通过建立CT26-luc细胞的小鼠PM-CRC模型，进行体内生物分布、抗肿瘤疗效及系统性安全性评价；并采用免疫荧光染色、蛋白质印迹等技术分析肿瘤微环境中的血管生成、缺氧及免疫细胞浸润等情况。
3.1. REG@LF NPs和REG@LFHA NPs的制备、表征及生物相容性评价
研究人员通过纳米沉淀法制备了REG@LF NPs，随后通过静电吸附将HA包裹在带正电的REG@LF NPs表面，得到REG@LFHA NPs。表征结果显示，REG@LFHA NPs（50% HA/LF质量比）水合粒径为188.57 nm，zeta电位为-27.59 mV，透射电镜显示其为球形。X射线衍射分析证实REG在纳米颗粒中以无定形态存在。载药量和包封率分别为9.33%和77.8%。生物相容性评价表明，载体材料LF和HA在多种细胞系中细胞毒性极低，且溶血率很低，显示出优异的生物安全性。
3.2. 细胞摄取和肿瘤球体穿透
通过共聚焦显微镜和流式细胞术评估，C6@LFHA NPs在CT26-luc细胞、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和M2极化骨髓来源巨噬细胞(M2-BMDM)中的摄取效率均显著高于C6@LF NPs，且该摄取可被游离的HA或LF竞争性抑制，表明其摄取由CD44和LRP-1受体共同介导。溶酶体共定位分析显示纳米颗粒具有有效的溶酶体逃逸能力。在CT26-luc多细胞肿瘤球体(MCTS)模型中，C6@LFHA NPs表现出比C6@LF NPs更深的穿透深度和更强的荧光信号，显示出优越的肿瘤球体穿透能力。
3.3. 生物分布与受体表达分析
体内分布实验表明，腹腔注射后，DiR@LFHA NPs和DiR@LF NPs在腹膜肿瘤区域显示出比游离DiR更强、更持久的荧光信号。离体器官成像进一步证实DiR@LFHA NPs在肿瘤组织中保持最强的荧光信号，而在主要器官中分布较低。免疫荧光染色显示，在PM-CRC肿瘤组织中，LRP-1和CD44受体的表达水平显著高于大多数正常器官，这为纳米颗粒的主动靶向提供了分子基础。
3.4. 体外抗肿瘤活性
在3D肿瘤球体模型中，REG@LFHA NPs与OxP联合处理显示出最强的肿瘤杀伤效果。在2D细胞培养中，CCK-8实验证实联合用药在所有浓度下均产生比任何单一药物更强的生长抑制，协同指数(CI)为0.82（在IC50水平），表明具有协同作用。机制研究表明，REG@LFHA NPs能浓度依赖性地诱导CT26-luc细胞晚期凋亡和G1期周期阻滞。OxP单药也引起G1期阻滞，可能与DNA损伤反应通路激活有关，两者联合使用时G1期阻滞最为显著。
3.5. 体外抗血管生成活性及机制
REG@LFHA NPs对HUVEC表现出浓度依赖性的细胞活力抑制，并能有效诱导细胞凋亡和G1期阻滞。在血管生成实验中，纳米颗粒能浓度依赖性地抑制HUVEC和SVEC4-10内皮细胞形成管状结构的能力，显著减少节点数、总管长和网格数。蛋白质印迹分析证实，REG@LFHA NPs能直接抑制VEGF诱导的VEGFR2磷酸化，从分子水平解释了其抗血管生成活性。
3.6. 对骨髓来源巨噬细胞的免疫调节作用
流式细胞术分析显示，与游离REG相比，REG@LFHA NPs处理能显著增加BMDM中CD86+M1型巨噬细胞比例，降低CD206+M2型巨噬细胞比例。载体材料LF本身即具有促进M1极化的能力。细胞因子检测发现，REG@LFHA NPs处理能显著提升细胞上清液中促炎细胞因子TNF-α和IL-6的水平，且效果强于LF或游离REG单独处理，表明药物与载体之间存在协同免疫刺激作用。
3.7. 体内抗肿瘤疗效及系统性安全性评价
在CT26-luc诱导的PM-CRC小鼠模型中，REG@LFHA NPs治疗组表现出显著的抗肿瘤活性，与对照组相比，肿瘤重量和生物发光强度分别降低了78.0%和64.5%。REG@LFHA NPs与OxP联合治疗产生了显著的协同抗肿瘤效应，肿瘤抑制率达到90.3%，显著优于所有单药治疗。免疫荧光分析显示，REG@LFHA NPs能有效抑制肿瘤血管生成（CD31阳性区域减少73.6%），并导致肿瘤内缺氧诱导因子HIF-1α表达上调。同时，该治疗能显著减少M2巨噬瘤内浸润（CD206阳性区域减少69.4%），并增加M1巨噬细胞比例。组织病理学和血清生化分析表明，REG@LFHA NPs具有良好的生物相容性和系统性安全性。
PM-CRC中的病理性血管不仅为肿瘤生存提供必要的营养支持，还促进了转移性播散。为克服常规REG治疗的药理学局限性，本研究采用LRP-1/CD44双靶向策略开发了REG@LFHA NPs，显著增强了肿瘤特异性药物蓄积，同时最大限度地减少了全身暴露。该创新纳米系统通过三种协同机制发挥全面的抗肿瘤作用：抑制肿瘤血管生成以破坏血氧供应，从而抑制肿瘤生长并降低转移潜能；通过与OxP的协同效应增强肿瘤细胞杀伤；通过REG和LF的联合作用，促进巨噬细胞从免疫抑制性的M2表型向抗肿瘤的M1表型复极化。体内结果证实，REG@LFHA NPs与OxP的联合疗法能显著抑制肿瘤进展，表现为肿瘤重量和生物发光信号的显著降低。该联合策略有效控制了原发性肿瘤生长和转移播散，同时保持了良好的安全性。本研究为REG@LFHA NPs作为PM-CRC潜在治疗策略的进一步开发提供了有价值的临床前证据。该研究成果发表于《Bioactive Materials》期刊。
