基于计算方法设计的N4-(2-甲基-2H-吲唑-6-基)-N2-苯基嘧啶-2,4-二胺类EGFR激酶抑制剂，该抑制剂靶向Cys797位点

《Bioorganic & Medicinal Chemistry》：Computationally guided design of N4-(2-methyl-2H-indazol-6-yl)-N2-phenylpyrimidine-2,4-diamine inhibitors of EGFR kinase targeting Cys797

EGFR-TK抑制剂研究：设计新型共价抑制剂改善对T790M/L858R双突变体的选择性，通过分子动力学和量子化学计算优化结构，发现化合物19对野生型EGFR抑制活性优于厄洛替尼，化合物48和49对双突变体抑制活性优于奥希替尼，同时提升磷酸缓冲液溶解性。

　　

阿德查塔·孔苏埃（Adchata Konsue）| 杜安卡莫尔·格里森（Duangkamol Gleeson）| 基阿塔维·乔翁科蒙（Kiattawee Choowongkomon）| 唐纳德·J·L·琼斯（Donald J.L. Jones）| 皮姆库安·汉南塔-阿南（Pimkhuan Hannanta-anan）| 罗伯特·G·布里顿（Robert G. Britton）| M·保罗·格里森（M. Paul Gleeson）

泰国曼谷拉德克拉邦国王蒙固技术学院工程学院生物医学工程系，邮编10520

摘要

表皮生长因子受体激酶（EGFR）是一种酪氨酸激酶（TK），与非小细胞肺癌的无控制生长有关。EGFR-TK抑制剂已被广泛使用，然而抑制剂耐药性常常出现，导致疾病进展。在这项工作中，我们报告了基于计算设计的新型共价2,4-二氨基嘧啶类EGFR-TK抑制剂，其设计灵感来源于奥西美替尼（Osimertinib）。我们对新型化合物进行了分子动力学模拟和量子力学（QM）计算，这些化合物在嘧啶的4位引入了2-甲基-2H-吲唑-6-胺结构，并结合了不同的连接基团和亲电试剂。计算结果表明，将嘧啶上的氢原子替换为氯原子后，配体会形成更有利于T790M突变的构象，这一结果后来也得到了实验验证。化合物19是对野生型EGFR（WT EGFR）最有效的抑制剂（浓度为3.0 nM），比EGFR WT抑制剂厄洛替尼（Erlotinib）的活性更强（5.9 nM）。化合物48和49对双突变型EGFR的活性也优于厄洛替尼（分别为3.0 nM和2.0 nM）。这些化合物对双突变型EGFR的选择性与奥西美替尼相当（约20倍），并且其磷酸盐缓冲液溶解度比两种市售药物高出50倍以上。对化合物48（含有丙烯酰胺亲电基团）和49（含有丙烯酰胺亲电基团）的动力学评估表明，后者的共价作用机制得到了证实，而前者则不是。

2009 Elsevier Ltd. 保留所有权利。

引言

受体酪氨酸激酶（RTKs）和非受体酪氨酸激酶（NRTKs）是作为细胞表面生长因子配体受体的蛋白质。生长因子配体特异性结合到RTKs的细胞外域，通过配体诱导的二聚化或寡聚化激活受体。配体结合后，细胞内的酪氨酸激酶结构域通过磷酸化被激活，引发构象变化，从而增强激酶活性。这种激活随后促进信号传导途径，尤其是在疾病背景下促进细胞增殖。

表皮生长因子受体酪氨酸激酶（EGFR）属于ErbB家族的受体酪氨酸激酶。它是参与细胞生长、增殖、存活和迁移的信号通路的关键调节因子。EGFR活性的失调已被确定为非小细胞肺癌（NSCLC）发生和进展的主要因素。

选择性小分子EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）已成为携带EGFR突变的重度NSCLC的一线治疗方法。尽管携带这些突变的患者通常对第一代EGFR TKIs（如厄洛替尼）反应良好，但大约一年后可能会产生耐药性。

在过去的20年里，开发出了多种不可逆的EGFR-TK抑制剂来解决激酶突变问题。这些抑制剂含有一个迈克尔受体结构，旨在与EGFR ATP结合位点边缘的保守半胱氨酸残基（Cys797）发生反应。奥西美替尼属于单氨基嘧啶类第三代TKIs，它通过其丙烯酰胺基团与Cys797共价结合，已被证明对常见的T790M EGFR突变体比第一代药物更有效。然而，由于临床中新突变的不断出现，继续开发新的EGFR靶向抗癌抑制剂是必要的。例如，最近批准了一种名为利姆替尼（Limertinib）的化合物，它是一种与奥西美替尼结构相关的二氨基嘧啶类化合物，能够针对具有外显子19缺失或外显子21突变的EGFR T790M突变体。

在这项研究中，我们采用了基于结构的设计策略，开发了新型的二氨基嘧啶类EGFR-TK抑制剂，灵感来源于单氨基嘧啶类化合物。我们的目标是设计并制备出对双突变体（DM）T790M&L858R具有更好活性和选择性的新分子。次要目标是改善这类化合物相对较低的溶解度。为此，我们进行了以下改进：(a) 在嘧啶环的4位引入了极性更高的2-甲基-2H-吲唑-6-胺结构，以改善整体理化性质；(b) 引入了能与Cys797反应的不同亲电基团；(c) 在嘧啶的2位引入了不同的芳香族连接基团以尝试提高溶解度和/或与Cys797的反应性；(d) 在靠近关键残基的嘧啶5位探索了构象策略，以增强对EGFR双突变体的选择性。

共合成了34种化合物，并评估了它们对野生型EGFR（WT EGFR）和双突变体T790M&L858R的构效关系（SAR）。选取了一部分化合物（IC50 < 50 nM）进行理化性质（logD7.4和磷酸盐缓冲液溶解度）和细胞毒性评估，实验对象包括EGFR过表达细胞系（A549）及人类肝细胞系（HepG2）。随后评估了前两种化合物的抑制动力学，以确认其作用机制。最后，通过分子动力学模拟和QM计算帮助我们理解了EGFR WT和DM SAR之间的差异。

设计

本研究中的合成修饰范围如图3所示。在嘧啶的4位引入了2-甲基-2H-吲唑-6-胺结构，主要是为了影响分子的总体亲脂性。该取代基的预测logP值相对较低（1.24），而奥西美替尼的N-甲基吲哚为2.80，利姆替尼的4a,8a-二氢萘-2-胺为2.44，厄洛替尼的3-乙炔基苯胺为1.59（见图S1）。

结论

在这项研究中，我们采用了基于结构的设计策略，开发了新型、改进的EGFR-TK抑制剂，灵感来源于奥西美替尼。我们的目标是设计出对双突变体T790M&L858R具有更好活性和选择性的新分子。次要目标是改善这类化合物相对较低的溶解度。 共合成了34种化合物，并评估了它们对野生型EGFR（WT EGFR）和双突变体（DM）的构效关系。其中两种化合物的活性和选择性最高。

化合物合成

所有试剂和溶剂均从商业供应商处购买，无需进一步纯化。使用TLC铝/硅胶板（Silicycle UltraPure Silica凝胶）进行薄层色谱（TLC）分析，并用紫外光可视化。化合物的纯化采用硅胶G60（60–200 μm）柱层析完成。¹氢核磁共振（¹H NMR）和¹³C核磁共振（¹³C NMR）谱在Jeol ECZ500/S1光谱仪上记录，分别在500 MHz（¹H NMR）和125 MHz（¹³C NMR）下进行。

CRediT作者贡献声明

阿德查塔·孔苏埃（Adchata Konsue）：撰写初稿、实验研究、数据分析。 杜安卡莫尔·格里森（Duangkamol Gleeson）：撰写、审稿与编辑、方法学研究、数据分析。 基阿塔维·乔翁科蒙（Kiattawee Choowongkomon）：监督工作、数据分析。 唐纳德·J·L·琼斯（Donald J.L. Jones）：撰写、审稿与编辑、监督工作、数据分析。 皮姆库安·汉南塔-阿南（Pimkhuan Hannanta-anan）：数据分析。 罗伯特·G·布里顿（Robert G. Britton）：撰写、审稿与编辑、监督工作、方法学研究、数据分析。

利益冲突声明

作者声明以下可能构成潜在利益冲突的财务利益和个人关系：马修·保罗·格里森（Matthew Paul Gleeson）表示获得了曼谷国王蒙固技术学院的财政支持；马修·保罗·格里森还获得了泰国国家研究委员会的财政支持；阿德查塔·孔苏埃（Adchata Konsue）也获得了泰国国家研究委员会的财政支持。如果还有其他作者，他们声明……

致谢

MPG感谢泰国国家研究委员会（National Research Council of Thailand）和曼谷国王蒙固技术学院提供的财政支持。AK感谢泰国国家研究委员会（NRCT）提供的皇家金禧年奖学金（NRCT5-RGJ63021-171）。