《Engineering Microbiology》：Pathway reprogramming and catalytic network engineering for the production of bioactive aspertetranones from deep-sea
Aspergillus versicolor ADS-F20
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本研究针对海洋真菌aspertetranones类化合物结构多样性和生物活性挖掘不足的问题，通过基因组挖掘在深海ADS-F20菌株中鉴定atn基因簇，利用米曲霉异源表达平台重构生物合成途径，通过关键酶Atn2/Atn5/Atn10等的组合表达实现17种衍生物的定向生物合成。研究发现化合物6对创伤弧菌(Vibrio vulnificus)和烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)具有显著抗菌活性(MIC=4.50/9.01 μg/mL)，化合物11对K-562等癌细胞株展现广谱抗癌效应。该研究为真菌meroterpenoids的结构多样性拓展和药物开发提供了新策略。
在浩瀚的海洋深处，蕴藏着无数微生物资源，其中真菌因其能够产生结构新颖、活性显著的次级代谢产物而备受关注。aspertetranones作为一类独特的海洋真菌meroterpenoids（默诺萜类化合物），以其高度氧化的线性6/6/6/6四环核心结构融合α-吡喃酮支架而著称。虽然Aspergillus ochraceopetaliformis中aspertetranones的生物合成途径已被部分解析，但这类化合物的全部潜力远未被充分挖掘。其结构多样性和修饰酶反应的宽泛底物特异性为通过组合生物合成技术开发具有生物活性的衍生物提供了广阔空间。
近期发表于《Engineering Microbiology》的研究中，冯培元等人针对深海来源的Aspergillus versicolor ADS-F20菌株，开展了一项系统性的生物合成研究。研究人员通过全基因组测序和生物信息学分析，成功鉴定了负责aspertetranones生物合成的atn基因簇。为了深入解析该途径并拓展产物多样性，研究团队采用了米曲霉（Aspergillus oryzae）NSAR1作为异源表达宿主，系统性地表达了12个关键基因，实现了完整途径的重构和17种代谢产物的定向生物合成。
在技术方法上，研究主要运用了全基因组测序与基因簇鉴定、米曲霉异源表达系统、体外酶活测定、代谢产物的分离纯化与结构鉴定，以及活性筛选（包括抗菌、抗炎和细胞毒性实验）。这些技术的综合应用使得途径解析和衍生物定向合成成为可能。
研究结果主要体现在以下几个层面：
3.1. 基因簇的发现与生物信息学分析
通过全基因组测序和AntiSMASH分析，在ADS-F20菌株中鉴定出atn基因簇，该簇包含12个基因，编码包括非还原型聚酮合酶（NR-PKS）Atn1、异戊烯基转移酶（PT）Atn3、FAD依赖的单加氧酶（FMO）Atn6和膜结合萜环化酶（CYC）Atn9在内的核心酶，以及多个负责后修饰的酶，如细胞色素P450（Atn4, Atn5, Atn7, Atn11）、Fe(II)/α-酮戊二酸依赖的双加氧酶（Atn2）和短链脱氢酶/还原酶（SDR）（Atn10）。
3.2. 四核心酶构建角形四环衍生物
通过逐步异源表达Atn1、Atn3、Atn6和Atn9，成功在米曲霉中重建了角形四环中间体6的生物合成途径。Atn1负责合成5-甲基三乙酸内酯（3），Atn3催化法尼基化生成4，Atn6形成环氧化物5‘，最终Atn9催化关键的环化反应生成角形四环骨架6。
3.3. 修饰酶底物宽泛性的初步探究
体外酶活实验表明，Atn10能将6氧化为7，Atn2则催化其羟基化生成8。当Atn2和Atn10共同作用时，8可被进一步氧化为9。喂养实验显示，Atn5和Atn11能分别以9为底物进行羟基化，生成10和11，但Atn4和Atn7则不能转化9。
3.4. Atn2、Atn5和Atn10组合生产天然产物
通过将Atn2、Atn5和Atn10以不同组合形式引入能合成6的米曲霉菌株，研究人员成功获得了包括7、8、9、10、11、12、13、14在内的多种角形四环衍生物。研究发现，由于这三个酶具有显著的底物宽泛性，中间体10可以通过六条不同的交叉途径从6生成，其中6→12→14→10（Atn5→Atn2→Atn10）被认为是天然生物合成过程中的主要途径。
3.5. 利用额外修饰酶实现产物多样化
进一步引入P450酶Atn7和Atn11，分别催化生成氧桥产物15和羟基化产物16。通过组合表达Atn4、Atn8和Atn12，成功将15转化为最终产物aspertetranone B（1），并将16转化为aspertetranone D（2），明确了终产物的生物合成路径。
3.6. 生物活性评价
对分离得到的16个meroterpenoids进行了抗炎、抗菌和抗癌活性筛选。结果显示，角形四环中间体6对烟草疫霉（Phytophthora nicotianae）和创伤弧菌（Vibrio vulnificus）ATCC 27562表现出显著的抗真菌和抗菌活性，MIC值分别为9.01 μg/mL和4.50 μg/mL。化合物11则对K-562、MCF7和PATU8988T等癌细胞株展现出强效且选择性的细胞毒性，其IC50值显著低于阳性对照药物顺铂。活性数据揭示了化合物结构与活性之间的构效关系，表明角形四环衍生物相较于线性四环类似物具有更优的生物活性。
综上所述，本研究通过途径重编程和催化网络工程，成功解析并拓展了深海真菌来源aspertetranones的生物合成途径。研究不仅阐明了其复杂的酶催化机制，还通过理性设计酶组合，实现了结构多样衍生物的定向生物合成，并发现了具有显著抗菌和抗癌活性的先导化合物。该策略凸显了合成生物学在挖掘微生物次级代谢产物宝库中的强大潜力，为基于真菌meroterpenoids的创新药物研发提供了坚实的理论和实践基础。所建立的“即插即用”式生物合成平台，对于其他复杂天然产物的途径解析和多样性创制也具有重要的借鉴意义。
