网络毒理学和多组学分析发现了与6PPDQ诱导的肝细胞癌相关的诊断基因，并阐明了其潜在的发病机制

《Environmental Pollution》：Network toxicology and multi-omics analyses identify diagnostic genes and elucidate underlying mechanisms of 6PPDQ-induced hepatocellular carcinoma

本研究通过整合网络毒理学、计算生物学和组学分析，揭示了6PPD-quinone（6PPDQ）诱导肝细胞癌（HCC）的分子机制。通过转录组数据和机器学习筛选出4个核心生物标志物（CHST4、SLC26A6、LY6E、FAM13A），并验证了6PPDQ与CHST4的稳定结合。构建了从环境暴露到肝癌的adverse outcome pathway（AOP），为早期诊断和治疗提供依据。

　　

Xulei Zuo|Xiaoyu Hou|Shiyi Tan|Cong Zhang|Yuxi Zhang|Rongli Sun|Yuepu Pu|Juan Zhang

教育部环境医学工程重点实验室，东南大学公共卫生学院，南京，210009，江苏，中国

摘要

随着轮胎生产的迅速扩张，抗氧化剂N-(1,3-二甲基丁基)-N'-苯基-p-苯二胺（6PPD）及其转化产物6PPD醌（6PPDQ）已成为广泛存在的环境污染物，并显示出毒性。本研究采用综合网络毒理学和计算框架，阐明了6PPDQ导致肝细胞癌（HCC）的机制。通过差异表达分析和加权基因共表达网络分析（WGCNA）对四个GEO数据集的转录组数据进行了处理，识别出923个与HCC相关的基因。与3844个预测的6PPDQ靶点相交后，得到了148个候选介导因子。GO和KEGG分析显示这些基因在异生物质代谢、氧化还原调节和致癌途径（如PI3K-Akt、TNF、p53）中富集。随后的机器学习分析确定了9个核心基因，其中CHST4、SLC26A6、LY6E和FAM13A形成了一个稳健的诊断标志物（AUC = 0.999；Hosmer–Lemeshow P = 1.0）。单样本基因集富集分析（ssGSEA）和单细胞RNA测序（scRNA-seq）证实了这些基因在特定细胞类型中的表达情况及其与免疫浸润改变的关联。分子对接和100纳秒动力学模拟显示6PPDQ与CHST4之间具有稳定的高亲和力结合（ΔG = ?9.1 kcal/mol）。最后，我们构建了一条将6PPDQ暴露与免疫失调和HCC发生联系的不良结局路径（AOP）。这项多组学和计算机模拟研究揭示了6PPDQ促进肝脏癌变的机制网络，确定了四个用于早期检测的候选生物标志物，并为未来的毒理学和治疗研究提供了概念性的AOP框架。

引言

随着汽车行业的快速发展，对橡胶轮胎的需求显著增加。据预测，2024年中国轮胎产量可能达到约11.2亿条，而全球年产量约为31亿条（Chen等人，2024年）。这一增长导致了与橡胶轮胎相关的化学污染物的大幅增加。其中一种化合物N-(1,3-二甲基丁基)-N'-苯基-p-苯二胺（6PPD）是一种关键的抗氧化剂，被添加到轮胎中以提高耐用性和延缓橡胶降解（Prosser等人，2023年）。该物质主要通过轮胎与路面摩擦产生的磨损颗粒（TWPs）进入环境（Hu等人，2023年）。释放后，它会迅速与大气中的臭氧反应，形成更持久的转化产物6PPD醌（6PPDQ）（Zhao等人，2023年）。此外，6PPD的生产和电子废物处理等工业活动加剧了其环境负担（Dai等人，2025年）。监测研究表明，6PPDQ存在于多个地区的地表径流水中，检出率在57%到100%之间，峰值浓度可达6.1 μg/L（Li等人，2025a；Tian等人，2021年）。6PPDQ可通过吸入、摄入和皮肤吸收等多种途径在生物体内积累（Li等人，2025b）。毒理学研究证实，6PPDQ对多种生物体具有毒性作用，包括斑马鱼、线虫和哺乳动物（Jiang等人，2024年）。值得注意的是，6PPDQ已被确定为北美沿海地区鲑鱼（Oncorhynchus kisutch）大规模死亡事件的致病因子（Shankar等人，2025年）。哺乳动物研究表明，它可能引起多器官毒性，具体表现为神经炎症、生殖能力下降和呼吸系统紊乱（Fang等人，2024年；He等人，2024年；Yao等人，2024年）。在斑马鱼胚胎中，6PPDQ暴露会增加神经元基因的表达，导致眼部畸形、中性粒细胞过度激活和胃肠道缺陷（Zhang等人，2023年）。在哺乳动物中，它具有强烈的生物累积潜力，并能激活核受体RARα和RXRα，从而产生内分泌干扰效应（Wang等人，2025年）。进一步的人类暴露研究表明，生活在污染地区的儿童尿液中6PPDQ水平显著升高，这突显了其对公共卫生的潜在影响（Dai等人，2025年）。综上所述，迫切需要全面研究6PPDQ暴露的潜在健康风险。

多项流行病学研究表明，6PPDQ暴露与肝脏和免疫系统功能障碍有关，尤其是在从事电子废物回收的人群中（Jiang等人，2024年）。肝脏作为异生物质积累和代谢的中心器官，已被确定为6PPDQ毒性的主要靶标，即使在低暴露水平下也是如此（Liao等人，2024年）。然而，其肝毒性的确切机制仍不明确。使用斑马鱼模型的研究提供了有关污染物如何破坏肝脏功能的宝贵见解。最新证据表明，6PPDQ可在啮齿动物和两栖动物（如黑斑蛙）的肝脏中积累，并导致脂质代谢紊乱（Liu等人，2024年）。在成年斑马鱼和虹鳟鱼中的研究进一步支持了6PPDQ在诱导肝脏组织氧化应激和代谢功能障碍中的作用（Kazmi等人，2024年）。通常，肝脏代谢紊乱会增加氧化应激并促进脂质过氧化，最终导致细胞损伤。小鼠口服6PPDQ剂量为10、30和100 mg/kg时，会在肝脏中积累，并上调参与糖脂代谢和谷胱甘肽途径的基因（Fang等人，2023年）。类器官模型显示，6PPDQ暴露会激活DNA修复、炎症和肿瘤发生相关的途径（Ge等人，2025年）。然而，对6PPDQ诱导肝脏毒性的机制仍缺乏全面了解。

肝细胞癌（HCC）是全球第六大常见恶性肿瘤，每年新增病例超过86万例，是癌症相关死亡的第三大原因（Luo等人，2025年；Xing等人，2024年）。近几十年来，其发病率急剧上升，主要是由于慢性病毒感染（乙型和丙型肝炎）、非酒精性脂肪肝病（NAFLD）和过量饮酒（Hong等人，2025年）。尽管临床管理有所进步，但预后仍然较差，大多数国家的五年生存率低于20%（Marquardt等人，2012年；Xu等人，2024年）。HCC的发病机制是多因素的，涉及遗传倾向、代谢紊乱和环境毒素暴露之间的复杂相互作用（Aasarey等人，2023年）。最近的研究将全氟烷基物质和某些金属等环境污染物与HCC风险增加联系起来，表明像6PPDQ这样的新兴污染物也可能在肝脏癌变中起作用（Liu等人，2021年）。由于其环境持久性和高生物累积潜力，6PPDQ可能破坏肝脏代谢并启动致癌途径。

计算毒理学的发展引入了研究环境化学物质生物影响的新方法。特别是网络毒理学提供了一个系统级框架，通过绘制6PPDQ等有毒化合物与其蛋白质靶点之间的相互作用，从而阐明受影响的信号通路（Zuo等人，2025年）。这种方法对于理解6PPDQ如何促进HCC的分子发病机制至关重要。通过整合多组学数据，基于网络的模型可以揭示6PPDQ如何扰乱细胞网络并推动疾病进展。功能富集分析，包括基因本体（GO）和京都基因组百科全书（KEGG），用于识别受该化合物影响的生物过程和分子功能。这些计算工具提供了对毒性机制的深入见解，有助于发现生物标志物，并支持治疗策略的开发。此外，分子对接模拟有助于确认6PPDQ与其生物靶点之间的特定蛋白-配体相互作用，为其毒性效应提供了结构基础。

为应对上述挑战，本研究提出了一个综合性的多维分析框架，用于研究6PPDQ诱导的HCC。该框架结合了网络毒理学、机器学习、转录组学和分子建模的方法。分析首先构建了一个网络毒理学图谱，以阐明可能与6PPDQ相关的HCC发病机制相关的关键信号通路。然后开发了一个基于机器学习的预测模型，以评估6PPDQ暴露的致癌风险并识别潜在的诊断生物标志物。最后，通过分子对接和分子动力学（MD）模拟验证了6PPDQ与识别出的核心靶点之间的结合相互作用。总体而言，本研究提供了关于6PPDQ诱导HCC的分子机制的新见解和方法策略，为早期风险评估和针对环境驱动的肝癌的治疗开发奠定了基础。

部分摘录

识别与HCC相关的靶点

与HCC相关的转录组数据来自NCBI GEO数据库，具体为GSE25097、GSE36376、GSE54236和GSE76427。其中，GSE25097和GSE36376用于初步分析（发现集），而GSE54236和GSE76427作为验证集。这四个数据集分别包含268/243、193/240、81/80和115/52个肿瘤样本与正常样本。为了解决潜在的批量效应，采用了全面的多步骤标准化策略。

预测与6PPDQ相关的靶蛋白

6PPDQ的分子结构来自PubChem数据库（图1A）。为了系统地识别其潜在的分子靶点，使用了三种独立的生物信息学工具：ChEMBL、CTD和SwissTargetPrediction。整合这些平台的输出并去除重复条目后，共识别出3844个独特的候选靶点（图1B）。

识别与HCC相关的靶基因

为了减轻潜在的批量相关偏差，将基因表达数据集GSE25097和GSE36376合并

讨论

工业化的迅速发展显著提高了全球生活水平，但也带来了严重的环境污染问题。其中，6PPD——一种广泛用于橡胶制造的抗氧化剂——常见于电缆、橡胶管、体育用品和游乐园设施等消费品中（Mayer等人，2024年）。其转化产物6PPDQ最近成为一种新的、广泛存在的环境污染物

结论

在这项研究中，我们使用网络毒理学和计算模拟来研究6PPDQ诱导的HCC。我们识别出148个候选靶点，并通过机器学习算法优先确定了四个核心基因（CHST4、FAM13A、LY6E、SLC26A6）。单细胞转录组分析证实了这些基因在6PPDQ诱导的肝毒性中的特异性表达。分子对接和MD模拟显示6PPDQ与这些靶点之间的稳定结合，其中CHST4的结合最强

CRediT作者贡献声明

Xulei Zuo：撰写——原始草稿，可视化，验证，软件，资金获取，概念化。Xiaoyu Hou：可视化。Yuepu Pu：撰写——审阅与编辑。Juan Zhang：撰写——审阅与编辑，监督。Yuxi Zhang：撰写——审阅与编辑，概念化。Rongli Sun：撰写——审阅与编辑。Shiyi Tan：撰写——审阅与编辑，方法学。Cong Zhang：撰写——审阅与编辑

数据可用性

数据可应要求提供。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

我们衷心感谢东南大学博士生创新能力提升计划（资助编号CXJH_SEU 25218）对这项研究的支持。