叶酸功能化氧化铋纳米颗粒：一种用于黑色素瘤声动力治疗的高效声敏剂

《Environmental Technology & Innovation》：Bi 2O 3@folic acid nanoparticles: An effective sonosensitizer for melanoma sonodynamic therapy

本研究针对黑色素瘤传统疗法副作用大、疗效有限的问题，开发了基于大黄提取物绿色合成的叶酸功能化氧化铋纳米颗粒（FA-Bi2O3NPs），系统评估其声动力疗法（SDT）效果。结果表明，FA-Bi2O3NPs可显著增强超声诱导的活性氧（ROS）生成，促进癌细胞凋亡并抑制迁移，在体外和3D肿瘤模型中均展现优异治疗潜力，且具备良好血液相容性，为靶向SDT提供了新材料策略。

　　

黑色素瘤作为皮肤癌中最具侵袭性的类型，全球发病率持续上升，其标准治疗手段如手术、化疗和放疗往往伴随严重副作用，且对深层或转移性肿瘤效果有限。近年来，声动力疗法（Sonodynamic Therapy, SDT）因其非侵入性、组织穿透深度大等优势成为研究热点。该疗法通过超声激活声敏剂，在肿瘤微环境中产生活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS），诱导癌细胞死亡。然而，传统声敏剂存在靶向性差、ROS产率低、易受肿瘤微环境（如缺氧、抗氧化系统）抑制等问题。因此，开发新型高效、靶向的声敏剂是推动SDT临床应用的關鍵。

为应对这一挑战，来自设拉子医科大学纳米医学与纳米生物学研究中心的M. Sarani、N. Sattarahmady等研究人员聚焦于氧化铋（Bi₂O₃）纳米材料。氧化铋纳米颗粒（NPs）具有良好的生物相容性、低系统毒性以及可调控的理化性质，在癌症治疗中展现出潜力。更重要的是，其半导体特性使其在超声辐射下能产生电子-空穴对，进而催化生成ROS。为了进一步提升其靶向性和疗效，研究团队创新性地将叶酸（Folic Acid, FA）与氧化铋纳米颗粒结合，利用叶酸受体在多种癌细胞（包括黑色素瘤细胞）表面过度表达的特点，实现主动靶向。此外，研究采用了一种环境友好的绿色合成方法，利用突厥大黄（Rheum turkestanicum）提取物制备纳米颗粒，符合可持续发展理念。相关研究成果发表在《Environmental Technology》上。

本研究主要采用了以下关键技术方法：首先，利用植物提取物进行纳米颗粒的绿色合成与功能化；其次，通过多种表征技术（如PXRD、FESEM、FTIR、UV-vis等）分析纳米颗粒的理化性质；第三，通过体外细胞实验（如MTT法、流式细胞术、荧光显微成像等）评估纳米颗粒的生物相容性、细胞摄取、ROS生成、细胞凋亡、线粒体膜电位（MMP）变化、细胞迁移抑制等效应；第四，利用3D肿瘤球体模型模拟体内肿瘤环境，评估纳米颗粒的穿透能力和治疗效果；最后，通过小鼠模型进行体内血液相容性评价。

3.1. 纳米颗粒表征

通过粉末X射线衍射（PXRD）确认合成的纳米颗粒为单斜晶系的α-Bi₂O₃。FA的引入使氧化铋纳米颗粒的晶粒尺寸从43.42 nm增大至57.90 nm。场发射扫描电子显微镜（FESEM）显示，FA功能化改变了氧化铋纳米颗粒的形貌，从无定形转变为锥状/棒状结构。能量色散X射线光谱（EDX）证实FA成功修饰到纳米颗粒上。紫外-可见光谱（UV-vis）分析表明，FA-Bi₂O₃NPs的带隙能（E_g）从3.27 eV降至2.95 eV，这有利于抑制电子-空穴对复合，提高ROS量子产率。纳米颗粒在生理介质中表现出良好的分散性和稳定性，且体外溶血实验证明其血液相容性符合安全标准。

3.2. 纳米颗粒对C540细胞的细胞毒性和放射增敏作用

MTT实验表明，FA-Bi₂O₃NPs对黑色素瘤C540细胞表现出浓度依赖性的细胞毒性，其IC₅₀值（21.2 μg mL^-1）远低于未功能化的氧化铋纳米颗粒（72.6 μg mL^-1）。值得注意的是，FA-Bi₂O₃NPs对正常成纤维细胞NIH3T3的毒性显著较低，显示出良好的选择性。细胞摄取实验证实，FA修饰显著增强了纳米颗粒被C540细胞（高表达叶酸受体）的内化，而在NIH3T3细胞（低表达叶酸受体）中摄取很少。当与超声（US）联合应用时，FA-Bi₂O₃NPs/US+组显示出最强的细胞杀伤效果，细胞存活率降至27.2%，证明了其作为声敏剂的有效性。

3.3. ROS生成和细胞内GSH降解测定

在无细胞体系和细胞内实验中，FA-Bi₂O₃NPs在超声辐射下均能产生更高水平的ROS，包括单线态氧（¹O₂）和羟基自由基。同时，FA-Bi₂O₃NPs/US+处理导致细胞内谷胱甘肽（GSH）水平显著下降（降低82.7%），表明其成功破坏了癌细胞的氧化还原平衡，削弱了其抗氧化防御能力。

3.4. 细胞凋亡测定

流式细胞术 Annexin V-FITC/PI双染结果显示，FA-Bi₂O₃NPs/US+处理诱导了最高比例的细胞死亡（80.2%），其中以早期和晚期凋亡为主，表明ROS触发了线粒体介导的凋亡通路。

3.5. 线粒体膜电位（MMP）检测

JC-1荧光染色实验表明，FA-Bi₂O₃NPs/US+处理导致MMP显著降低，荧光从红色（聚合体，高MMP）转变为绿色（单体，低MMP），证实了线粒体功能受损是诱导凋亡的重要机制。

3.6. 伤口愈合实验

细胞划痕实验证明，FA-Bi₂O₃NPs联合超声处理能有效抑制C540细胞的迁移能力，这对于抑制肿瘤转移具有重要意义。

3.7. 肿瘤球体形成

在3D肿瘤球体模型中，FA-Bi₂O₃NPs联合超声显示出更强的生长抑制效果，并且增加超声循环次数（至3次）可进一步增强疗效，存活率降至14.1%。深层穿透实验表明，PI标记的FA-Bi₂O₃NPs能够有效扩散至球体内部，证明了其良好的肿瘤穿透能力。

3.8. 体内血液相容性

对Balb/c小鼠的体内实验表明，静脉注射FA-Bi₂O₃NPs后5天，血液生化指标和血细胞参数未出现显著异常，表明其在短期内具有良好的血液相容性和生物安全性。

综上所述，本研究成功开发了一种基于植物绿色合成的叶酸功能化氧化铋纳米颗粒（FA-Bi₂O₃NPs），并将其作为一种高效的声敏剂用于黑色素瘤的声动力治疗。该系统的主要优势在于：1）绿色合成方法环境友好；2）FA修饰赋予其主动靶向能力，增强肿瘤细胞摄取并减少对正常细胞的副作用；3）FA的引入优化了纳米颗粒的能带结构，提高了超声下的ROS产率；4）在二维和三维肿瘤模型中均证实了其通过诱导ROS爆发、耗竭GSH、降低MMP、促进凋亡和抑制迁移等多重机制发挥强大的抗肿瘤效果；5）初步体内实验显示了良好的生物安全性。该研究不仅为黑色素瘤治疗提供了一种有前景的靶向SDT新策略，而且其绿色合成理念和多功能纳米平台的设计思路也为其他纳米医学研究提供了借鉴。未来的研究可聚焦于深入探索其凋亡信号通路细节、优化治疗参数（如超声条件）、以及在更复杂的体内肿瘤模型中验证其疗效和长期安全性，推动其向临床转化。