《European Journal of Medicinal Chemistry》：Synthesis, antidepressant evaluation and computational insights on substituted pyrazoles as selective MAO-A inhibitors
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MAO-A抑制剂筛选与分子机制研究：合成21个吡唑啉酮衍生物，VK16和VK19表现出强效可逆抑制MAO-A活性（IC50分别为0.06±0.017和0.09±0.019 μM），其抑制可经底物稀释100倍恢复68%酶活性。体外抗氧化实验和分子对接/动力学模拟证实其高选择性和稳定性，为新型抗抑郁药开发提供候选化合物。
迪克莎·乔杜里（Diksha Choudhary）、拉杰温德·考尔（Rajwinder Kaur）、凯拉什·詹吉德（Kailash Jangid）、维诺德·库马尔（Vinod Kumar）、布平德·库马尔（Bhupinder Kumar）、蒂莎娜·辛格（Thishana Singh）、阿姆里特帕尔·考尔（Amritpal Kaur）、沙琳·辛格（Shareen Singh）、曼金德·辛格（Manjinder Singh）、塔库尔·古尔吉特·辛格（Thakur Gurjeet Singh）、巴拉库马尔·钱德拉塞卡兰（Balakumar Chandrasekaran）
印度旁遮普邦拉杰普拉（Rajpura）的奇特卡拉大学（Chitkara University）奇特卡拉药学院（Chitkara College of Pharmacy），邮编140401
摘要
设计、合成了一系列吡唑衍生物，并通过光谱方法对其进行了表征。所有合成的化合物均通过体外（in vitro）和体内（in vivo）方法评估了其抗抑郁活性。其中，VK16和VK19是MAO-A酶的最强抑制剂，其IC50值分别为0.06 ± 0.017 μM和0.09 ± 0.019 μM，显示出与参考标准物相当的效果。此外，还测试了这些化合物的可逆性，发现它们是MAO-A酶的可逆抑制剂，因为用底物溶液稀释100倍后，酶活性可恢复超过68%。体内的FST和TST结果与体外MAO抑制实验的结果高度一致。进一步通过体外实验评估了这些化合物的抗氧化特性，并通过分子对接（molecular docking）、分子动力学（MD）模拟和密度泛函理论（DFT）研究（计算机模拟）对其进行了分析。分子对接结果显示，这些化合物与关键氨基酸残基的相互作用更强，对接得分也优于已研究的对照药物。所有选定的化合物均表现出良好的药代动力学（ADME）特性，包括良好的血脑屏障穿透性和胃肠道吸收性。分子动力学模拟和DFT研究也证实了VK16和VK19在MAO-A结合位点上的稳定性。总体而言，VK16和VK19是很有前景的抗抑郁候选药物，值得进一步临床研究。
引言
抑郁症是一个持续存在的问题，与日常生活中挑战引起的普通情绪波动和短暂的情绪反应截然不同[1]。其症状至少可持续两周，有时会持续数周、数月甚至数年，最终可能导致自我毁灭[2]。神经递质（NTs）水平低下最终会导致精神疾病，如果不加以治疗，在最严重的情况下，自杀企图可能会增加[3]。根据世界卫生组织（WHO）的数据，抑郁症影响了全球约3.8%的人口（3.32亿人），其中60岁以上人群的比例为5.7%，成年人中这一比例为5.9%（男性4.6%，女性6.9%）。在15至29岁的人群中，自杀是抑郁症导致的第四大死亡原因。2021年，估计有727,000人死于自杀[4]。
单胺氧化酶（MAO）位于线粒体外层，主要负责神经递质的脱氨基作用。MAO有两种形式：MAO-A（单体形式）和MAO-B（二聚体）[5]、[6]、[7]。这两种MAO异构体具有相同的作用机制，称为“极性亲核机制”。这两种酶都参与催化胺类底物的α-碳氧化，生成亚胺物种，随后亚胺通过水解产生醛和铵。MAO-A主要存在于大脑、胃肠道（GIT）、胎盘和心脏中[8]。在胃肠道黏膜中，MAO-A通过催化饮食中的胺类物质降解，防止过量酪胺进入血液循环。肠道中MAO-A的抑制会导致食物中的酪胺在血液循环中的浓度升高，从而增加去甲肾上腺素（NE）的水平。这种情况被称为“奶酪效应”[9]。在MAO-A不可逆抑制的情况下，食物中的酪胺无法代谢，其血液中的水平会超过最佳范围，导致周围神经系统分泌肾上腺素，从而引起高血压[10]、[11]。伊普罗尼嗪（Iproniazid）是20世纪50年代发现的第一个作为MAO抑制剂的抗抑郁药，但由于其导致高血压的副作用，该药物已从市场上撤下[12]。肝脏损伤主要是由于伊普罗尼嗪的代谢产物——异丙基肼（isopropylhydrazine）引起的[13]。同样，MAO-A也是心脏中H2O2的主要来源[13]。一些风险，如酪胺引起的高血压，限制了MAO-A抑制剂的临床应用。MAO-A对血清素和NE的选择性代谢使其成为开发新型抗抑郁药的主要靶点[14]。
目前，氯丙嗪（Clorgyline，选择性和不可逆）和莫氯贝胺（Moclobemide，选择性和可逆）是少数获得FDA批准的MAO-A抑制剂。然而，由于氯丙嗪的丙炔基团与MAO-A酶的FAD辅因子共价结合，因此未上市销售[14]。尽管莫氯贝胺是一种有效的药物，但它仍存在显著的副作用。一些非选择性的不可逆MAO抑制剂包括异卡巴肼（Isocarboxazid）、伊普罗尼嗪（Iproniazid）、曲兰西普明（Tranylcypromine）和苯乙肼（Phenelzine）（见图1）[15]、[16]。曲兰西普明和苯乙肼有一些严重的副作用，如自杀念头、药物相互作用、癫痫发作和低血压。不过，它们作为二线治疗药物使用时需要严格限制饮食[17]。伊普罗尼嗪因肝毒性被撤出市场。
含氮杂环化合物存在于许多生理活性分子中，在药物化学和有机化学中非常重要，并引起了新药物发现的兴趣[18]。其中，喹啉类、吲哚类、吡咯类和吡唑类在药物研究中尤为突出[19]、[20]、[21]。为了进行合理的药物设计，吡唑结构的部分特性和性质在药物设计中起着重要作用。由于吡唑结构具有药理活性，它在新药开发中非常重要[22]。本研究选择吡唑结构来探索其抗抑郁潜力以及选择性MAO-A抑制作用[23]、[24]、[25]。一些关于吡唑基团的研究表明，它们具有更好的亲和力和更少的副作用，文献中也报道了许多成功的吡唑衍生物合成方法（见图1中的结构1至5）[26]、[27]。肼类衍生物促进了MAO抑制剂的开发，但它们有一些严重的副作用，如肝中毒和“奶酪效应”[28]。许多研究表明，丙炔基基团有助于这些化合物的不可逆性[17]。此外，研究表明，在环内引入氮原子（如吡唑环）可能赋予MAO-A选择性[29]。
氨基酸Glu 151被Lys残基取代，这种特定突变可能导致hMAO-A二聚体界面处的二聚体结构不稳定。人类MAO-B的活性位点形状比hMAO-A更长更窄[30]。hMAO-B中的腔形环由六个残基组成，与hMAO-A相比，其构象更为紧凑，这可能改变了活性位点的形状和体积。hMAO-A和hMAO-B酶的晶体结构见图2。
尽管MAO-A和MAO-B具有很高的相似性，但它们的选择性不同。hMAO-A的活性氨基酸残基包括Tyr-69、Tyr-444、Gln-74、Ser-209、Val-210、Phe-208、Leu-97、Val-91、Ile-325、Glu-216、Cys-323、Met-350、Leu-337、Ile-207、Ile-180、Tyr-407、Val-93和Ile-335。MAO-B的活性氨基酸残基包括Thr-201、Gln-65、Val-82、Cys-172、Ile-198、Thr-314、Tyr-60、Phe-343、Ile-199、Glu-84、Ser-200、Leu-171、Ile-316、Leu-328、Glu-207和Tyr-435[33]。根据文献，芳香族残基Tyr-407和Tyr-444可能形成三明治状排列，从而增强底物结合稳定性和MAO的催化活性[34]、[35]。分子对接显示了配体与蛋白质之间的结合取向，而分子动力学（MD）模拟有助于理解分子的行为，并基于描述原子相互作用的物理模型预测蛋白质或任何分子系统中各个原子的运动情况。这些模拟可以揭示许多重要的生物分子过程，如构象变化、配体结合和蛋白质折叠，以飞秒精度追踪每个原子的位置。重要的是，MD模拟还可以显示生物分子在原子水平上对各种变化（如突变、磷酸化或配体的添加或去除）的反应[36]。密度泛函理论（DFT）用于研究物质的分子结构并预测其反应性。这是一种强大的计算量子力学建模方法，用于物理和化学中分析多体系统的电子结构[37]。
目前可用的抗抑郁药物在治疗效果上往往不够理想，因此需要开发能与更多介质相互作用的新药物。这一挑战促使研究人员开发创新策略。由于MAO-A主要降解神经递质，导致神经递质水平降低，从而影响情绪调节[38]。因此，可逆抑制MAO-A成为阻止抑郁症中神经递质降解的重要目标。不可逆和非选择性的MAO-A抑制剂可能导致多种副作用，如消化不良、胃痛、睡眠障碍以及更严重的问题，如心律不齐和癫痫发作[39]。hMAO-B中的腔形环由六个残基组成，其构象比hMAO-A更为紧凑，这可能改变了活性位点的形状和体积[40]。为了克服这些副作用，我们设计并合成了含有吡唑的化合物，这些化合物可能具有可逆性和对MAO-A的选择性。此外，还通过分子对接、MD模拟和DFT研究获得了关于最活跃化合物的进一步计算见解。
化学部分
化学过程
目标化合物的合成是通过方案1进行的。查尔肯-施密特缩合反应（Claisen-Schmidt condensation reaction）在常规方法和微波辅助条件下完成。4-morpholinoacetophenone与取代苯甲醛在碱性条件下反应，生成目标化合物（VK1-VK21）。中间体（C1-C15）的合成和表征在我们之前发表的论文中已有介绍[10]。对于最终产品，
结论
合成了一系列取代吡唑（VK1-VK21），并通过光谱方法对其进行了表征，并初步筛选了它们对hMAO-A和hMAO-B异构体的抑制潜力（体外实验）。最终选择了六种最活跃的化合物，并测定了它们对hMAO-A和hMAO-B酶的IC50值。其中，VK16和VK19是活性最强的抑制剂，IC50值分别为0.06 ± 0.017 μM和0.09 ± 0.019 μM，对hMAO-A的选择性分别超过330倍和210倍
一般信息
所有溶剂和化学品均来自Sigma-Aldrich（印度班加罗尔）和Takyo Chemical Industry（TCI），为分析级，并未经纯化直接使用。反应通过预涂层的薄层色谱（TLC）铝片G/UV 254（印度孟买Loba Chemie Private Limited）在紫外柜中进行监测。熔点（MP）使用Digital MP仪器（Popular India）和Biocote进行记录。CEM Discover也被用于
作者贡献声明
巴拉库马尔·钱德拉塞卡兰（Balakumar Chandrasekaran）：撰写、审稿与编辑、项目管理、概念构思。塔库尔·古尔吉特·辛格（Thakur Gurjeet Singh）：撰写、审稿与编辑、资源准备。迪克莎·乔杜里（Diksha Choudhary）：撰写、原始草稿、概念构思。阿姆里特帕尔·考尔（Amritpal Kaur）：撰写、审稿与编辑、验证、方法学。蒂莎娜·辛格（Thishana Singh）：撰写、审稿与编辑、软件使用、方法学。曼金德·辛格（Manjinder Singh）：资源准备、方法学。沙琳·辛格（Shareen Singh）：撰写、审稿与编辑、可视化、实验设计。凯拉什·詹吉德（Kailash Jangid）：撰写——
数据可用性
本研究生成或分析的所有数据均包含在本文及补充信息中。如有进一步查询，请联系通讯作者。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
作者感谢印度旁遮普邦帕蒂亚拉（Patiala）拉杰普拉（Rajpura）奇特卡拉大学（Chitkara University）提供的研究设施。作者BC感谢Zarqa University对本项目的部分资助。TS感谢南非国家研究基金会提供的竞争性研究计划资助[CPRR230527110705]，并感谢南非开普敦的高性能计算中心（CHPC）的支持
