《Food Hydrocolloids》：Genipin as a natural cross-linker strengthens pea protein gel: a mechanistic study
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豌豆蛋白凝胶的天然交联剂优化研究：genipin通过剂量依赖性增强悬液粘弹性和储能模量，调控蛋白二硫键和自由氨基水平，促进纳米级均质网络形成，抑制大颗粒聚集，同时不影响蛋白质消化率。
作者：Enning Zhou、Kwan You、Lai Wei、Sunandita Ghosh、Jan Ilavsky、Da Chen
美国普渡大学食品科学系，地址：745 Agriculture Mall Dr, West Lafayette, IN 47907
摘要
植物蛋白通常由于其共价交联作用有限，其凝胶化能力不如动物蛋白。因此，寻找天然的交联剂以解决这一问题至关重要，同时要尽量减少安全风险。本研究探讨了天然色素和交联剂genipin对豌豆蛋白（PP）悬浮液及其热固化凝胶的流变性能、微观结构和消化率的影响。结果表明，genipin以剂量依赖的方式提高了PP悬浮液的表观粘度和储能模量。功能基团测定和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示，genipin降低了PP中的游离氨基和巯基含量，同时增加了颗粒大小和高分子量聚集体比例。热固化过程中，genipin浓度越高，PP凝胶的粘弹性、特征松弛时间和残余应力也越大。共聚焦激光扫描和扫描电子显微镜观察发现，genipin的添加逐渐减少了裂纹和聚集体的大小，使凝胶网络更加连续均匀，壁层更细腻。超小角X射线散射实验表明，genipin抑制了大聚体的形成，稳定了中等大小的聚集体，并引入了纳米级的异质性。基于溶剂的解离实验显示，随着genipin浓度的增加，蛋白质的提取率持续下降，这与共价固定作用一致。体外消化实验表明，genipin的交联并未改变蛋白质的消化率；然而，含有genipin的凝胶消化物中的高分子量肽的水解程度低于不含genipin的对照组。这些发现表明，genipin能有效交联豌豆蛋白，从而在多个尺度上增强凝胶网络的稳定性，为提高基于豌豆蛋白的食品的硬度提供了一种环保方法。
引言
植物蛋白是高质量的氮源，同时也是决定许多植物性食品质地和营养成分的关键成分（Yu, Wang, & Zhang, 2023）。其中，豌豆蛋白（PP）因其广泛的可用性、低致敏性、非转基因特性以及相对温和的风味而被广泛用于肉类替代品、可食用凝胶（Chen et al. 2021）、蛋白质饮料（Lu et al., 2020）和3D打印食品（Zhu et al., 2024）中（Burger & Zhang, 2019; Lam et al., 2018）。然而，豌豆蛋白的凝胶化能力通常比大豆蛋白（Sun & Arntfield, 2011）、鹰嘴豆、菜豆等植物蛋白较弱（Ge et al., 2023）。
豌豆蛋白凝胶化能力较低的原因在于其主要球蛋白vicilin、convicilin和legumin的分子结构。vicilin缺乏半胱氨酸残基，convicilin中含有的含硫氨基酸较少（Croy et al., 1980），这些因素限制了凝胶化过程中的巯基-二硫键交换。legumin由六个二硫键连接的α/β链组成，亲水性的α链暴露在外，而疏水性的β链则被包裹在内。加热时，疏水残基的有限暴露限制了疏水相互作用（Reinkensmeier et al., 2015），因此通常需要较高的初始蛋白浓度才能达到所需的硬度和结构完整性。
为提高豌豆蛋白的凝胶化能力，人们采用了多种方法，包括调节pH值（Chen et al. 2024）、使用盐或CaCl?进行离子修饰（Tanger et al., 2022）、添加多糖（Guo et al., 2026; Zhang, Chen, Patel & Campanella, 2022）、控制蛋白质水解程度（Chen & Campanella, 2022）以及转谷氨酰胺酶（TGase）处理（Shand et al., 2008）。虽然pH值和离子强度的调节有助于非共价相互作用，但可能影响食品的感官特性（Lv et al., 2022）。多糖-蛋白质体系若配方不当，还可能发生热诱导的相分离（van den Berg et al., 2007）。蛋白质水解程度的精确控制至关重要，因为过度水解会降低凝胶化能力并产生苦味肽（Humiski & Aluko, 2007; Galante et al., 2020）。化学交联剂虽然能有效增强植物蛋白凝胶的强度，但许多合成交联剂（如戊二醛和甲醛）因安全问题不适合用于食品（Tacias-Pascacio et al., 2019）。
Genipin是一种从Gardenia jasminoides中提取的天然环烯醚萜类化合物（Sigurdson, Tang, & Giusti, 2017），可作为食品交联剂使用。genipin中的活性烯醇醚基团（–O–C=C–）可与蛋白质氨基反应，引发二氢吡喃环的开环并形成席夫碱（亚胺）中间体，随后通过迈克尔加成反应形成稳定的交联结构。在这一过程中，genipin-蛋白质复合物在氧气存在下会发生自氧化，生成共轭产物（如醌衍生物），赋予体系特有的蓝色。Genipin历史上被用作东亚食品的天然着色剂，最近也被美国食品药品监督管理局批准作为某些食品的添加剂（《联邦法规》第21章第73.168节）。研究表明，genipin交联可提高明胶（Morrish & Kasapis, 2024）、银杏籽蛋白（He et al., 2023）和麻籽蛋白-油乳液凝胶（Wang et al., 2019）的粘弹性、硬度和/或保水性，并能增强基于豌豆蛋白的生物塑料的强度（Pérez -Puyana et al. 2023; Pérez -Puyana et al., 2024）。然而，genipin对热固化豌豆蛋白凝胶的流变性能、微观/纳米结构、蛋白质-蛋白质相互作用以及这些结构变化与消化率之间的关联仍不甚明确。值得注意的是，豌豆蛋白富含赖氨酸，为genipin交联提供了丰富的ε-氨基。Genipin-蛋白质反应在常温下即可发生（He et al., 2023），这可能改变了蛋白质在加热前的表面性质和聚集状态。这种预凝胶化修饰会影响最终凝胶的网络结构，进而影响其粘弹性和消化行为。
在本研究中，豌豆蛋白通过碱性等电沉淀法分离，并分散在含有0–15 mM genipin的磷酸盐缓冲液中。对所得悬浮液进行了粘弹性行为、颗粒大小分布、表面性质、分子量分布以及游离氨基（–NH?）和巯基（–SH）含量的分析。随后进行热固化反应，并通过流变学方法监测溶液-凝胶转变过程。凝胶的微观结构、纳米结构和分子间相互作用分别通过扫描电子显微镜（SEM）、同步辐射超小角和小角X射线散射（USAXS/SAXS）及基于溶剂的提取技术进行了研究。这些分析揭示了genipin调控凝胶网络形成并增强豌豆蛋白凝胶粘弹性的分子机制。
材料
绿色裂荚豌豆种子在当地购买。Tris–Tricine缓冲液和预制的SDS-PAGE凝胶由Bio-Rad Laboratories（美国加利福尼亚州Hercules）提供。Pierce?改良Lowry蛋白质测定试剂盒（目录号23240）、分析级七水合磷酸二钠、一水合磷酸一钠、硫酸、盐酸、氢氧化钠、8-氨基-1-萘磺酸（ANS）、尿素、硫脲和二硫苏糖醇（DTT，纯度≥98%）以及Bradford试剂也用于实验。
含与不含genipin的豌豆蛋白悬浮液的流变性能
随着genipin浓度的增加，豌豆蛋白悬浮液的颜色从淡黄色变为棕色（图1A），这是由于genipin与胺类化合物反应生成有色产物的结果（Koyama et al., 2023）。在含有genipin的凝胶表面还观察到一层淡蓝色，这主要是由于氧化作用所致。
结论
本研究证明，genipin交联能够以剂量依赖的方式增强豌豆蛋白悬浮液和凝胶的稳定性。交联过程在常温下开始，并在整个热固化过程中持续进行。在悬浮液中，genipin使豌豆蛋白颗粒变大；而在凝胶中则表现为相反的趋势，可能是由于genipin在加热过程中限制了蛋白质的运动并抑制了大聚体的形成。
作者贡献声明
Sunandita Ghosh：方法学研究、实验设计。
Jan Ilavsky：写作、审稿与编辑、数据管理。
Enning Zhou：写作、原始草稿撰写、方法学研究、数据管理。
Kwan You：写作、审稿与编辑、数据管理。
Lai Wei：方法学研究。
Da Chen：写作、审稿与编辑、结果验证、项目监督、方法学研究、资金申请、概念构思。
未引用参考文献
Arntfield et al., 1990; 《联邦法规》，2025; Renkema and van Vliet, 2002.
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
数据获取
数据可应要求提供。
资助信息
本研究部分得到了Good Food Institute提供的催化剂基金（编号：22-PB-US-FCA-1-333）的支持，用于购买化学试剂和消耗品。
致谢
