《Glycoscience & Therapy》：Stearylamine enriched lipid-polymer hybrid nanoparticles of ursolic acid for targeting
Leishmania donovani:
In-vitro studies
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本研究针对熊果酸(UA)水溶性差、生物利用度低等问题，开发了硬脂胺(SA)修饰的脂质-聚合物杂化纳米粒(UA-LPHNPs)。通过质量源于设计(QbD)方法优化制备的纳米粒具有纳米尺寸、正电荷表面及高包封率，能显著增强巨噬细胞靶向及细胞内积累。体外研究表明，UA-LPHNPs相比标准药物帕罗霉素展现出更强的抗利什曼原虫活性，并通过分子对接验证了UA与关键靶点MOGS酶的稳定结合，为内脏利什曼病的治疗提供了新型纳米递送策略。
内脏利什曼病是一种由杜氏利什曼原虫引起的系统性寄生虫感染，主要侵袭巨噬细胞，若不及时治疗会导致致命的器官损伤。尽管现有化疗药物如两性霉素B、米替福新等具有一定疗效，但其应用常受限于毒性、耐药性、高成本及给药不便等问题。更为棘手的是，天然活性分子熊果酸虽显示出卓越的抗利什曼原虫潜力，但其极低的水溶性（0.12 μg/L）和不足3%的口服生物利用度严重制约了其临床应用。因此，开发一种能够高效递送熊果酸、并特异性靶向寄生有原虫的巨噬细胞的纳米载体，成为突破当前治疗瓶颈的关键。
为此，研究人员在《Glycoscience》上发表了最新研究成果，他们设计并优化了一种装载熊果酸的硬脂胺修饰脂质-聚合物杂化纳米粒，旨在克服熊果酸的理化缺陷，并增强其对杜氏利什曼原虫的靶向杀伤作用。
为开展本研究，研究人员主要应用了几项关键技术：首先，采用基于质量源于设计理念的Box-Behnken实验设计法，对纳米粒的处方和工艺参数（如硬脂胺与聚合物比例、药物量、超声时间）进行系统优化，以精准控制纳米粒的粒径和表面电荷。其次，通过纳米沉淀法制备熊果酸脂质-聚合物杂化纳米粒。在表征方面，运用动态光散射法测定纳米粒的粒径、多分散指数和Zeta电位，透射电子显微镜观察其形貌，并采用傅里叶变换红外光谱、差示扫描量热法和粉末X射线衍射法进行固体状态表征。此外，建立了反相高效液相色谱法用于药物含量和释放度测定。在生物学评价中，采用刃天青荧光法测定纳米制剂对利什曼原虫前鞭毛体的半数抑制浓度和对巨噬细胞的半数细胞毒性浓度，并计算选择性指数；通过荧光显微镜观察荧光标记纳米粒的巨噬细胞摄取情况。最后，利用分子对接技术模拟熊果酸与利什曼原虫关键酶曼诺糖基-寡糖葡萄糖苷酶的相互作用。
3.1. BBD integrated with the nanoprecipitation method yielded UA-LPHNPs with desirable physicochemical attributes
通过Box-Behnken设计结合纳米沉淀法，研究人员成功制备出具有理想理化性质的熊果酸脂质-聚合物杂化纳米粒。优化结果表明，当硬脂胺与聚己内酯比例为5:5，熊果酸投药量为5 mg，超声时间为2.5分钟时，可获得最佳纳米粒。实测纳米粒的平均粒径为141.9 ± 5.35 nm，多分散指数为0.2713 ± 0.0152，Zeta电位为+24.78 ± 0.06 mV。透射电镜证实纳米粒呈球形，分布均匀。纳米粒的包封率和载药量分别达到88.15 ± 0.35%和2.72 ± 0.21%。固体状态表征（傅里叶变换红外光谱、差示扫描量热法、粉末X射线衍射）结果显示，熊果酸被成功包载于脂质-聚合物基质中，并以无定形态存在。体外释放研究表明，熊果酸脂质-聚合物杂化纳米粒在72小时内呈现缓慢持续的释放行为，累积释放度达到80.96 ± 2.13%，其释放机制符合Korsmeyer-Peppas模型，释放指数n为0.364，表明药物主要通过Fickian扩散释放。
3.2. UA-LPHNPs exhibited potent anti-leishmanial activity against L. donovani with enhanced uptake in macrophages
熊果酸脂质-聚合物杂化纳米粒对杜氏利什曼原虫表现出强大的抗寄生虫活性，并增强了巨噬细胞摄取。荧光显微镜观察显示，与单纯的香豆素-6染料悬浮液相比，香豆素-6标记的脂质-聚合物杂化纳米粒在RAW264.7巨噬细胞中的摄取显著增加。抗寄生虫活性测定表明，熊果酸脂质-聚合物杂化纳米粒对利什曼原虫前鞭毛体的半数抑制浓度仅为3.35 ± 0.13 μg/mL，显著低于标准药物帕罗霉素的40.12 ± 1.38 μg/mL，甚至优于游离熊果酸。同时，熊果酸脂质-聚合物杂化纳米粒对巨噬细胞的细胞毒性较低，其选择性指数达到3.21，高于游离熊果酸的1.85和帕罗霉素的2.67，表明纳米制剂对寄生虫具有更好的选择性毒性。
3.3. UA from UA-LPHNPs exhibited binding with MOGS protein, a new target in the L. donovani parasite
分子对接研究揭示，熊果酸脂质-聚合物杂化纳米粒中的熊果酸能与杜氏利什曼原虫的一个新靶点——曼诺糖基-寡糖葡萄糖苷酶稳定结合。通过SiteMap分析在曼诺糖基-寡糖葡萄糖苷酶蛋白上确定了5个潜在结合位点，其中位点1因其较高的SiteScore和Dscore被选为最佳结合口袋。分子对接结果显示，熊果酸与曼诺糖基-寡糖葡萄糖苷酶的对接得分为-2.856 kcal/mol，其羟基与Arg 517残基形成氢键相互作用。尽管其对接得分低于帕罗霉素，但仍显示出稳定的结合模式，这为熊果酸通过抑制曼诺糖基-寡糖葡萄糖苷酶、干扰利什曼原虫糖蛋白加工、从而发挥抗寄生虫作用的机制提供了理论支持。
综上所述，本研究成功构建了硬脂胺修饰的熊果酸脂质-聚合物杂化纳米粒，该纳米系统具有良好的理化特性、缓释行为、高效的巨噬细胞靶向性和强大的体外抗利什曼原虫活性。其作用机制不仅包括纳米粒本身通过正电荷介导的巨噬细胞靶向和摄取，以及硬脂胺对寄生虫细胞膜的直接破坏作用，还可能涉及所包载的熊果酸对利什曼原虫特异性糖基化关键酶曼诺糖基-寡糖葡萄糖苷酶的抑制。该纳米递送系统有效克服了熊果酸自身溶解度低、生物利用度差的难题，为内脏利什曼病的治疗提供了一种极具前景的新型纳米药物候选物，值得在更严谨的体内模型中进行后续评价，以推动其向临床转化。
