在大肠杆菌（E. coli）系统中表达和生产重组SARS-CoV-2 RBD蛋白：比较三种菌株的性能、功能性和稳定性

《Protein Expression and Purification》：Expression and production of recombinant SARS-CoV-2 RBD protein in E. coli system: comparison of performance, functionality and stability in three strains

本研究通过在三种埃希氏大肠杆菌表达菌株中合成并评估重组RBD蛋白，发现BL21（DE3）表达量最高，Rosetta-gami亲和力最强，且所有菌株表达的rRBD蛋白具有相似结构和抗原性。优化IPTG浓度（1mM）和低温保存（-20℃或4℃）可确保蛋白稳定性和长期保存。验证了大肠杆菌系统在高效生产SARS-CoV-2诊断抗原中的可行性。

　　

Romina Golafshan|Mahmoudreza Aghamali|Mohammad Javad Rasaee

伊朗拉什特吉兰大学理学院生物化学系

摘要

全球范围内的COVID-19大流行是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-Cov-2）引起的。SARS-Cov-2的受体结合域（RBD）位于刺突蛋白上，该蛋白能够与ACE2结合并相互作用。RBD是开发病毒中和抗体、疫苗和抑制剂的关键靶点。本研究的目的是合成重组RBD（rRBD）蛋白，并评估其在不同大肠杆菌（E. coli）菌株中的表达、功能及稳定性。通过计算机模拟方法对rRBD结构域基因序列进行了优化，并利用XhoI和EcoRI限制性内切酶将其插入pET-28a载体中。选择了三种大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)、Rosetta-gami和Shuffle T7进行蛋白质合成。通过PCR验证了目标基因片段的克隆情况。将经过验证的重组载体克隆到这三种大肠杆菌菌株中。利用SDS-PAGE和Western blot分析检测rRBD的表达情况，采用远紫外圆二色性（CD）光谱技术分析其二级结构。ELISA实验量化了rRBD蛋白与HRP标记的抗His抗体的相互作用，并使用抗人免疫球蛋白-HRP检测COVID-19患者的血清。在不同温度条件下评估了蛋白质的稳定性。在1mM IPTG浓度下，所有三种菌株均能高效表达rRBD蛋白。Western blot结果显示，三种菌株中均检测到14kDa的rRBD蛋白条带，其中BL21菌株的表达量最高。Rosetta-gami菌株产生的rRBD对抗His抗体的亲和力最强。三种菌株表达的蛋白质具有相似的二级结构，主要以无规卷曲和β-折叠片层为主。它们对来自COVID-19患者的抗体的亲和力也相似。在-20°C和4°C下储存，并加入适量的甘油，可确保蛋白质的长期稳定性。本研究表明，大肠杆菌仍是一种适合生产功能性SARS-Cov-2 RBD蛋白的良好且灵活的宿主系统。尽管各菌株的表达水平和结合能力存在差异，但所生成的蛋白质具有相似的结构和抗原特性。这些发现验证了利用细菌表达系统生产基于RBD的诊断试剂的可行性。

引言

冠状病毒（COVID-19）于2019年12月下旬在中国武汉首次出现，随后迅速在全球范围内传播并演变成大流行病[1]。人类冠状病毒（hCoVs）是一种具有正链单链RNA基因组的包膜病毒[2]。SARS-Cov-2含有四种主要结构蛋白，其中三聚体刺突蛋白（S蛋白）通过其受体结合域（RBD）与ACE2（血管紧张素转换酶-2）结合，从而帮助病毒进入宿主细胞[3]。刺突蛋白上的RBD与宿主细胞受体的结合是病毒感染的初始步骤，这种相互作用决定了病毒的宿主范围和跨物种传播能力[4]。RBD是病毒与宿主细胞血管紧张素转换酶2（ACE2）受体结合的关键部分。中和抗体（NAbs）主要针对RBD发挥作用[5]。RBD由220个氨基酸残基组成，包含两个N-糖基化位点和九个半胱氨酸残基，其表观分子量为34 kDa，而实际氨基酸序列的分子量为27 kDa。RBD的N-和O-糖基化模式对其免疫原性、稳定性和蛋白质折叠至关重要[6]。SARS-CoV-2的RBD具有高度免疫原性，包含多个抗原位点，负责90%的血清中和作用，因此是开发COVID-19治疗药物的理想候选蛋白[7]。 过去一个世纪中，重组蛋白（RP）表达技术的出现极大地推动了生物技术的发展[8]。随着生物技术的进步，重组蛋白的生产量从克级提高到了千克级，应用范围也从传统食品和化工领域扩展到了医药产品[9]。多项研究表明，包括酵母、昆虫、哺乳动物细胞和大肠杆菌（E. coli）在内的多种表达系统均可用于生产SARS-Cov-2 RBD[10, 11]。某些研究表明，大肠杆菌产生的SARS-Cov-2 RBD具有保护作用[12, 13]。此外，SARS-Cov-2 S蛋白的RBD（N318-V510）已被生产出来，并作为经济有效的抗原用于全球血清学检测[14]。尽管大肠杆菌不具备生成完全天然RBD所需的糖基化机制，但由于许多表位为线性结构或不受糖链影响，细菌表达对于制备诊断试剂仍具有重要意义[15]。大肠杆菌因其低成本、生长要求低、蛋白质合成生理和遗传特性明确、能够快速大规模生产重组蛋白以及易于改造等优点，成为下游生物过程的主要表达宿主[16]。 经过改造的菌株如BL21(DE3)、Rosetta-gami 2 (DE3)和Shuffle T7能够改善二硫键的形成并减少蛋白水解，从而可能影响RBD的折叠和抗原特性[16]。本研究通过比较三种宿主，旨在找到适合生产功能性rRBD的有效细菌系统，以用于SARS-Cov-2抗体的血清学检测。虽然已有许多研究使用不同的表达方法来生产SARS-Cov-2 RBD，但大多数研究仅关注单一宿主或特定优化技术。针对细菌系统的研究通常侧重于溶解性或重折叠方法；相比之下，直接比较具有不同折叠能力的改良大肠杆菌菌株的研究较少。酵母和哺乳动物表达系统虽然能产生接近天然构象的糖基化RBD，但往往制造成本较高且培养时间较长。尽管缺乏糖基化修饰，基于大肠杆菌的方法仍能快速高效地合成蛋白质，适用于血清学检测[17]。 本研究选择了BL21(DE3)、Rosetta-gami 2 (DE3)和Shuffle T7三种大肠杆菌菌株进行比较研究，因为不同的细胞环境可能影响蛋白质的生产和质量。选择BL21菌株是因为其缺乏蛋白酶且能大量表达目标蛋白[18]。Rosetta-gami菌株基于著名的BL21菌株，继承了其高产蛋白的特性。这些菌株通过改造谷胱甘肽还原酶和硫氧还蛋白还原酶途径（Δgor ΔtrxB）来促进细胞质中二硫键的形成，这对多种蛋白质的正确折叠至关重要[19]。Shuffle T7菌株适用于生产含有二硫键的蛋白质，其表达的蛋白质二硫键异构酶能够破坏错误的二硫键并形成正确的二硫键[20]。该菌株经过改造，能够更好地表达含有稀有密码子的真核蛋白，从而提高表达效率。根据现有研究，SARS-CoV2 S蛋白的RBD区域在该病毒的感染和致病过程中起关键作用。因此，本研究旨在在不同宿主中表达重组RBD（rRBD）蛋白，并通过ELISA方法检测其在感染患者体内的抗体。

rRBD的计算机模拟设计

刺突蛋白序列来自国家生物技术信息中心（NCBI），访问代码为YP_009724390.1。使用该序列在https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi进行了BLAST搜索。利用PSI-BLAST（位置特异性迭代BLAST）功能识别高度相似的蛋白质序列。通过//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/提供的NetNGlyc-1.0软件预测了RBD蛋白上的潜在糖基化位点。

rRBD的生物信息学设计

刺突蛋白序列来自NCBI数据库（参考序列：YP_009724390.1）。接下来选取了刺突蛋白的RBD区域进行进一步研究。MSA分析结果支持了先前研究的结果，证实了rRBD蛋白的保守区和变异区。预测RBD蛋白中有22个天冬酰胺残基会发生N-糖基化。

讨论

COVID-19的快速全球传播凸显了开发可扩展、低成本抗原生产系统的重要性，这些系统适用于诊断、治疗和疫苗研发[21]。SARS-Cov-2刺突蛋白的RBD通过ACE2相互作用实现病毒侵入，使其成为血清学和功能检测的重要抗原。然而，在原核系统中实现RBD的正确折叠颇具挑战性，因为其功能构象较为复杂

结论

本研究总结了优化大肠杆菌中rRBD生成的关键因素。尽管BL21 (DE3)菌株产生的蛋白质量最多，但Rosetta-gami菌株产生的rRBD具有更好的折叠质量，更适合需要可靠表位呈现的检测应用。值得注意的是，所有三种rRBD变体在COVID-19患者样本中的抗体识别结果相似，表明细菌生产方式可生成具有相似特性的抗原

CRediT作者贡献声明

Mahmoudreza Aghamali： 负责监督工作。Romina Golafshan： 执行实验研究。MJ Rasaee： 负责监督工作

资助情况

未声明任何资助来源

利益冲突声明

作者声明不存在利益冲突

致谢

作者衷心感谢吉兰大学提供的实验室和研究设施