综述：合成生物学策略激活链霉菌中隐性生物合成基因簇：用于抗生素发现的天然和合成启动子工程

《ACS Omega》：Synthetic Biology Strategies for Activating Cryptic BGCs in Streptomyces: Engineering Native and Synthetic Promoters for Antibiotic Discovery

本综述系统阐述了利用合成生物学策略，特别是通过工程化改造天然和合成启动子，来激活链霉菌中隐性生物合成基因簇（BGCs）以发现新型抗生素的前沿进展。文章详细比较了组成型、诱导型及杂合启动子系统的设计原理与应用，并深入探讨了CRISPR激活系统、机器学习辅助的启动子设计以及多操作子BGCs的CRISPR多重激活平台等尖端技术。该文为如何通过精确的转录调控挖掘微生物“暗物质”以应对日益严峻的抗菌素耐药性（AMR）危机提供了系统级的理解和技术路线图，对天然产物发现领域具有重要的指导意义。

　　

开发用于激活隐性BGCs的组成型启动子

组成型启动子能够在所有条件下以稳态水平驱动靶基因的转录。在链霉菌中，启动子的活性主要由初级σ因子（如HrdB，属于σ⁷⁰家族）识别其核心启动子区域的-35和-10六聚体序列来决定。通过对链霉菌启动子结构的分析，发现其被HrdB识别的启动子通常具有TTGAC样的-35元件和扩展的-10基序（TGNNANNNT）。

天然组成型启动子，如源自链霉菌持家基因的启动子，因其保守的转录结构而成为稳定的表达工具。例如，源自³⁰S核糖体蛋白S12基因的^rpsL启动子和源自甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的^gapdh启动子，在不同链霉菌宿主中均表现出强转录活性。转录组学指导的方法显著推进了强天然启动子的发掘。例如，研究人员在^{Streptomyces albus}J1074中系统筛选了32个候选启动子，发现了多个活性远超合成标准启动子^ermE*p的强启动子，如启动子2、6、15和31。

合成组成型启动子库的构建策略主要分为三类：I型库对启动子序列进行部分随机化；II型库除-10和-35保守序列外完全随机化；III型库则完全随机化调控区（不包括-10、-35和核糖体结合位点序列）。例如，通过对^kasO*p启动子的间隔区或-10元件下游区域进行随机化，成功构建了转录强度范围很广的启动子库，其中最强的^SP44*p用于工程化^{Amycolatopsis japonicum}，使[S,S]-乙二胺二琥珀酸的产量提高了约8倍。另一个著名的合成启动子^P21，其转录活性可达^ermEp1的318%，并在多种放线菌中表现出稳定的强活性，用于表达黄蓟素产量提高了3.3倍。

用于可控基因表达的诱导型启动子

诱导型启动子能响应特定的环境或化学信号，实现基因表达的时间控制，这对于避免组成型强表达可能带来的代谢负担和毒性效应至关重要。

硫链丝菌素诱导型启动子^PtipA源自^{S. lividans}。其转录激活蛋白TipAL与诱导剂硫链丝素结合后，可使其转录水平提高200倍。ε-己内酰胺诱导型系统使用源自^{Rhodococcus rhodochrous}J1的NitR转录激活因子及其对应的^nitA启动子，在链霉菌中实现了严格可控的基因表达。甘油诱导型系统利用^{S. coelicolor}中^gylCABX操纵子的调控元件，其表达受GylR阻遏蛋白调控，可被甘油诱导并被葡萄糖抑制。

光诱导型系统利用LitR/CarH家族蛋白作为光敏转录调节因子。该蛋白结合腺苷B₁₂（adoB_{12）作为发色团，在无光条件下阻遏靶启动子（如^litSp）的转录；暴露于蓝绿光后，LitR-羟基-B12复合物形成，解除了阻遏，从而启动转录。该系统已成功用于链霉菌中代谢物的光控生产。}

四环素诱导型启动子^tcp830是将^{E. coli}转座子Tn10的TetR/^tetO阻遏/操纵子系统改造后用于链霉菌的成功范例。通过将^tetO1和^tetO2操纵子序列置于启动子的不同区域，筛选出了高效构建体^tcp830，其诱导因子高达270，并已用于新生霉素BGC的工程化，实现产量可调。

纤维二糖诱导型、氧四环素诱导型、间苯三酚/枯酸诱导型等合成诱导系统也被开发出来，它们通常将强组成型启动子（如^hrdBp、^kasO*p）与异源阻遏蛋白/操纵子对（如CebR/^cebO、OtrR/^otrO、RolR/^rolO、CymR/^cmtO）结合，实现了低背景泄漏和高动态范围的基因表达控制。

用于BGC激活的合成启动子

合成启动子工程已从随机突变发展为定量设计和计算优化的表达系统。机器学习框架（如DeepPromAct、DNNProm）利用转录组数据训练模型，能够预测启动子强度并优化其架构，从而加速启动子的合理设计。

正交调控元件的创建是另一个前沿领域。例如，合成σ因子系统（如源自^{E. coli}的Eσ^X–P_X模块）和CRISPR介导的激活（CRISPRa）系统（如dCas9-SAM或dCas12a系统）能够实现对多个基因簇的独立、可编程控制，最大限度地减少了与宿主天然转录网络的串扰。这些正交框架为隐性BGCs的多重激活提供了强大工具。

异源启动子在抗生素基因簇激活中的应用

启动子工程已成功应用于激活多种类型的隐性BGCs，用于生产聚酮化合物、非核糖体肽、核糖体合成和翻译后修饰肽（RiPPs）等天然产物。

在聚酮化合物和杂合PKS-NRPS代谢物方面，强组成型启动子如^kasOp和^ermEp被广泛应用于激活模块化PKS或杂合基因簇。例如，利用^kasOp和^hrdBp的多启动子策略，在^{S. albus}J1074中重构了源自^{S. spectabilis}的隐性硝基芳香族聚酮化合物——壮观霉素的生物合成途径。对于氨基香豆素和硝基芳基化合物，如新生霉素，通过使用^tcp830启动子替换其BGC中的天然启动子，并在异源宿主^{S. coelicolor}中表达，成功实现了该抗生素的生产。

在环化四酰胺大环内酯（PTMs）的重构方面，采用“即插即用”的启动子插入策略，成功激活了来自^{S. albus}和^{S. griseus}的隐性PTM基因簇，产生了新的PTM家族化合物。靛蓝苷合成酶基因^bpsA（编码NRPS）常被用作启动子活性的可见报告基因。通过合成启动子库（如III型库）激活隐性Lazarimide（^lzr）BGC，成功产生了吲哚咔唑、铬吡咯中间体以及主要代谢产物lazarimide A。

通过CRISPR激活多操作子簇

对于由多个操作子组成的隐性BGCs，其激活需要同时替换多个启动子，这对技术提出了挑战。CRISPR系统的发展极大地提高了多操作子BGC重构的效率和规模。

多重CRISPR转录激活和抑制（mCRISTAR）、多重整合酶辅助CRISPR激活系统（miCASTAR）以及整合酶辅助的CRISPR重组和编辑设备（iCASRED）等平台，将CRISPR-Cas系统与同源重组（如酵母TAR）或重组酶（如RecET）相结合，实现了对BGC中多个启动子的高效、同步替换。例如，利用mCRISTAR技术成功替换了四个启动子盒中的八个启动子，效率达20-60%。改进型的mpCRISTAR技术使用多个gRNA表达质粒，成功替换了八个启动子盒中的十六个启动子，效率达32%。CRISETR技术则成功应用于重构结构复杂（含大量直接重复序列）的达托霉素BGC，通过不同强度启动子的组合，使达托霉素产量提高了20.4倍。

然而，CRISPR激活系统仍面临脱靶活性、遗传不稳定性、转录干扰和负担、动态范围有限以及激活效率的上下文依赖性等挑战。未来的改进将依赖于优化的引导RNA设计算法、稳定性优化的载体架构以及对脱靶网络的定量表征。

用于可调和正交调控的杂合和模块化启动子系统

杂合启动子将不同来源的调控元件（如强核心启动子与上游操作子或增强子序列）组合起来，实现多层次转录控制。例如，^ermE*p-^lacO杂合启动子可在^{S. coelicolor}中实现IPTG诱导的调控；^kasOp-^tipA融合启动子则实现了高基础转录与硫肽诱导的精确激活相结合。CRISPR响应的杂合启动子整合了dCas9-VP64的最小PAM近端结合位点，允许通过外部向导RNA进行转录控制，而无需染色体修饰。

这些模块化架构提供了精细的可调性、正交调控（减少串扰）、便于多层通路平衡，并通过使用绝缘的5‘-UTR或终止子增强了在不同宿主中的背景独立性（表达稳定性）。尽管功能强大，杂合启动子也可能因重复序列出现不稳定性，并受到宿主因子相互作用和诱导剂扩散差异的影响。

启动子工程用于BGC激活的挑战与局限

尽管前景广阔，启动子工程在实际应用中仍面临一些挑战。组成型强表达可能造成巨大的代谢负担，与初级代谢竞争前体、ATP和还原力，导致生长缓慢、产量降低和发酵不稳定。使用动态或反馈控制的启动子可以缓解这一问题。

意外的调控串扰也是一个关键问题。许多合成和杂合启动子可能无意中与宿主调控网络相互作用。开发正交调控架构（如合成σ因子系统）是解决方案之一。基于质粒的启动子库或多拷贝构建体在大型BGCs中易发生重组事件和重排，使用整合载体、位点特异性重组酶和染色体“安全港”整合位点可以提高稳定性。

从工业角度看，放大重现性和宿主特异性变异仍是瓶颈。在实验室规模优化的启动子活性，在大型生物反应器的高密度或补料分批条件下可能会因氧气、pH和营养梯度而发生变化。过程适应性启动子（如响应溶解氧或群体感应信号的启动子）是潜在的解决方案。

启动子、基因组和代谢工程的整合

下一代抗生素发现将依赖于整合了启动子工程、基因组编辑和代谢工程的设计框架。CRISPR-Cas系统（如iCASRED， miCASTAR）允许同步进行启动子替换和多基因座激活，大大加快了BGC重构速度。

基因组尺度代谢模型（GEMs）可用于预测前体通量并识别通路瓶颈，从而为选择匹配的启动子强度或拷贝数提供信息，以维持代谢平衡。将启动子活性与代谢物传感器或转录反馈回路耦合的动态控制电路可以进一步优化发酵过程中的通量分布。

启动子工程、基因组工程和代谢工程的融合，建立了一个用于理性激活隐性BGCs的闭环设计-构建-测试-学习（DBTL）管道，将链霉菌从天然产物发现的模型生物转变为可编程的细胞工厂，用于生产下一代抗生素和治疗剂。