微波合成7-氯喹啉氨基酸衍生物：细胞毒性、抗氧化潜力及与β-微管蛋白的分子对接研究

《ACS Omega》：Microwave Synthesis, Evaluation, and Docking Study of Amino Acid Derivatives of 7-Chloroquinoline: Exploring Cytotoxic and Antioxidant Potentials

本文报道了通过苯并三氮唑介导的微波合成法，高效制备了一系列新型7-氯喹啉氨基甲酸酯及氨基酸衍生物，并系统评估了其抗氧化活性（DPPH法）及对LNCaP、A2780、MCF-7等癌细胞的体外细胞毒性（MTT法，IC50）。分子对接研究表明，先导化合物（如4b）可与β-微管蛋白（β-tubulin）紫杉醇结合位点高亲和力结合，提示其可能模拟多西他赛（docetaxel）的抗癌机制，为开发新型抗癌剂提供了有价值的结构线索。

　　

引言

癌症仍然是全球性的健康挑战，其发病率和死亡率持续上升，对公共卫生系统构成沉重负担。自由基对细胞的损伤是导致癌症等多种退行性疾病的重要因素，而抗氧化剂在预防这些疾病中扮演着关键角色。7-氯喹啉作为一种重要的芳香杂环药效团，其衍生物展现出广泛的生物活性，包括抗疟、抗癌、抗结核、抗菌和抗氧化等。本研究旨在通过一种绿色、高效的合成方法，开发新型的7-氯喹啉衍生物，并探索其在癌症治疗中的潜力。

结果与讨论

合成与表征

研究采用苯并三氮唑介导的微波合成法，成功制备了五个Z-保护（Cbz）和三个Boc-保护的7-氯喹啉氨基酸衍生物（4a-h），以及它们的两个去保护类似物（5a, b）。该方法在四氢呋喃（THF）中于70°C下微波辐射1小时完成，反应步骤简单，产率良好。所有化合物均通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）、核磁共振氢谱（¹H NMR）、碳谱（¹³C NMR）和高分辨质谱（HRMS）进行了充分的结构表征和确认。例如，化合物4a的¹H NMR谱中显示出特征性的酰胺NH、氨基甲酸酯NH以及7-氯喹啉环上芳香质子的信号，其HRMS谱中[M + H]⁺峰为m/z 427.1531，与理论计算值一致。

生物活性

抗氧化活性

通过DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）自由基清除实验评估了所有合成化合物的抗氧化能力。结果显示，所有化合物均具有一定的抗氧化活性，但均低于标准抗氧化剂BHT（丁基羟基甲苯）。其中，化合物4c表现出最显著的剂量依赖性自由基清除活性，在125 μg/mL浓度下清除率达到50.17%。化合物4b、4h和5a显示出中等活性，而其他化合物活性较弱。结构-活性关系分析表明，保护基团的存在与否对活性有显著影响。例如，去保护后的化合物5a（具有游离-NH₂基团）的抗氧化活性明显高于其Boc-保护的前体4g，这可能是由于游离氨基能够更好地提供氢原子或电子以淬灭自由基。

细胞毒性研究

采用MTT法评估了化合物对三种人类癌细胞系（前列腺癌LNCaP、卵巢癌A2780和乳腺癌MCF-7）的细胞毒性作用，并计算了24小时处理后的半数抑制浓度（IC₅₀）。多西他赛（docetaxel）作为阳性对照药。在所有测试化合物中，化合物4b表现出最强的抗癌活性，其对LNCaP、A2780和MCF-7细胞系的IC₅₀值分别为6.61、2.81和5.69 μg/mL，活性与多西他赛（IC₅₀值分别为0.58、0.37和0.56 μg/mL）相比虽有一定差距，但在合成物中最为突出。结构-活性关系分析揭示，连接链的长度和末端氨基的存在是关键因素。具有较短乙烯连接链的化合物4b活性最高，而具有较长丙烯连接链的化合物（如4a, 4g）活性降低，表明过度的柔性可能不利于与靶标结合。更重要的是，去除Boc保护基得到游离氨基的衍生物5a和5b，其细胞毒性显著增强，远高于其相应的保护前体4g和4h，表明末端氨基是重要的药效团，可能通过氢键或离子相互作用增强与分子靶标的结合和/或促进细胞摄取。细胞存活率数据进一步证实，大多数化合物在10和100 μg/mL浓度下对三种癌细胞系均表现出显著的细胞毒性（p < 0.05）。

分子对接研究

为了探究活性化合物的潜在作用机制，针对活性最高的化合物4a、4b和5a，以β-微管蛋白（PDB ID: 1TUB）为靶点进行了分子对接研究。β-微管蛋白是多西他赛的作用靶点，其通过稳定微管结构、引起G₂/M期细胞周期阻滞和凋亡而发挥抗癌作用。对接结果显示，化合物4a、4b和5a均能很好地嵌入β-微管蛋白的紫杉醇结合口袋。它们的结合能分别为-10.19、-9.81和-8.74 kcal/mol，而多西他赛的结合能为-8.85 kcal/mol，表明4a和4b与靶蛋白的理论结合亲和力甚至优于多西他赛。相互作用分析表明，这些化合物不仅能够重现多西他赛与β-微管蛋白的部分关键相互作用（如与Leu275、Ala233等的疏水作用），还能形成额外的氢键（如4a与Ser236和Arg320，4b与Arg320、Asp26、Ser236和Arg369）。这些额外的相互作用可能有助于稳定化合物与靶标的结合。研究结果推测，化合物4a、4b和5a可能通过类似于多西他赛的机制，即稳定微管、抑制其解聚，从而诱导癌细胞凋亡。

结论

本研究成功通过微波辅助的苯并三氮唑介导方法合成了一系列新型的7-氯喹啉氨基甲酸酯和氨基酸衍生物。生物学评价表明，部分化合物具有中等程度的抗氧化活性和显著的细胞毒性，其中化合物4b对三种测试癌细胞系均表现出最强的抑制活性。分子对接研究揭示了这些活性化合物与β-微管蛋白紫杉醇结合位点具有高亲和力，提示其可能模拟多西他赛的抗癌机制。该研究为基于7-氯喹啉骨架开发新型潜在抗癌药物提供了有价值的先导化合物和理论依据。

实验部分

实验所用化学品和溶剂均为合成级。核磁共振谱使用DMSO-d₆或CDCl₃作为溶剂在400 MHz（¹H）和101 MHz（¹³C）谱仪上测定。熔点使用Gallenkamp熔点测定仪测定。反应进程通过薄层色谱（TLC）监控。

N¹-(7-氯喹啉-4-基)烷二胺的合成

将4,7-二氯喹啉与过量的烷二胺混合，在80°C下微波辐射搅拌60分钟。反应结束后，经二氯甲烷萃取、碱洗、干燥、浓缩后得到中间体2a和2b。

7-氯喹啉-4-基-氨基甲酸酯衍生物的合成

将中间体2a或2b与相应的Z-或Boc-保护的氨基酸-苯并三氮唑活性酯（Bt酯）在三乙胺存在下，于THF中70°C微波辐射1小时。反应完成后，经后处理并通过二氯甲烷/正己烷混合溶剂重结晶纯化，得到目标化合物4a-h。

未保护的7-氯喹啉-4-基-氨基甲酸酯衍生物的合成

将Boc保护的衍生物（4g, 4h）溶于三氟乙酸（TFA）和二氯甲烷（DCM）的混合溶液中，室温搅拌1小时进行脱保护。反应完成后，经碱化、乙酸乙酯萃取、干燥、浓缩得到去保护产物5a和5b。

体外抗氧化研究

采用DPPH自由基清除法评估抗氧化活性。将化合物配制成不同浓度的DMSO溶液，与DPPH溶液反应后于517 nm测定吸光度，计算自由基清除率。

细胞毒性评估

使用LNCaP、A2780和MCF-7细胞系，通过MTT法评估细胞毒性。细胞与不同浓度的化合物孵育24小时后，加入MTT溶液，继续孵育后溶解生成的甲瓒晶体，在570 nm波长下测定吸光度，计算细胞存活率和IC₅₀值。

分子对接

使用MolView和Avogadro软件构建和优化配体分子结构。从蛋白质数据库（PDB）获取β-微管蛋白晶体结构（1TUB）。使用AutoDockTools准备蛋白和配体文件，采用AutoDock Vina进行分子对接计算，对接区域设定在紫杉醇结合位点。对接协议通过将多西他赛重新对接到其原始结合位点进行验证。

统计分析

使用IBM SPSS Statistics和MedCalc软件进行数据分析。数据以均值±标准差表示。采用Shapiro-Wilk检验数据正态性，组间比较使用Kruskal-Wallis H检验，事后比较使用Bonferroni校正的Mann-Whitney U检验。IC₅₀值使用GraphPad Prism软件计算。p < 0.05被认为具有统计学显著性。