《ACS Omega》：Electrochemically Engineered GQDs for Selective Tumor Targeting and Oxidative Nanotherapy in Triple-Negative Breast Cancer
编辑推荐：
本工作报道了一种快速可持续的电化学方法，利用维生素C作为氧化还原缓冲剥离剂，在氢氧化钠调控的离子环境下，由富含缺陷的石墨烯片制备石墨烯量子点（GQDs）。所得GQDs（3–10 nm）具有激发依赖性绿色荧光、高水分散性（ζ电位 = -28.3 mV）和适度的氧化程度（富含氧官能团）。体外研究表明，其通过细胞内活性氧（ROS）生成对三阴性乳腺癌（TNBC）细胞产生选择性细胞毒性，而对正常成纤维细胞无害。体内荧光成像证实了GQDs在4T1荷瘤BALB/c小鼠中的肿瘤优先蓄积、肾脏清除和系统生物相容性。与常规方法相比，该策略反应时间更快、化学危害更小、治疗相关性更高，为TNBC的图像引导及ROS放大的纳米诊疗提供了一个具有临床转化潜力的绿色纳米平台。
引言
石墨烯作为一种由sp2杂化碳原子排列成的二维蜂窝状晶格材料，因其卓越的电导率、机械强度、热稳定性和高比表面积，在纳米材料领域引发了革命。石墨烯量子点（GQDs）作为其纳米结构衍生物，凭借其微小尺寸（3–10 nm）、量子限域效应和可调光致发光等特性，在纳米医学的诊断、治疗和成像应用中展现出巨大潜力。然而，如何可控地合成具有特定尺寸、良好生物相容性且低化学残留的GQDs仍是一大挑战。传统方法如柠檬酸的热解或混合酸（H2SO4/HNO3）氧化切割，往往需要长反应时间、高温或危险化学品，限制了其可扩展性和体内应用。电化学剥离作为一种在温和水相条件下制备GQDs的自上而下方法应运而生，但多数方案仍依赖强氧化剂或金属离子，存在细胞毒性风险。本研究旨在开发一种可持续、超快速的电化学合成方法，利用缺陷工程化的石墨烯片和生物相容的维生素C作为氧化还原缓冲剥离剂，制备具有治疗相关性的GQDs，并对其进行全面的体内外验证。
电解质中阴离子浓度对GQDs形成的作用机制与角色
GQDs的电化学剥离过程使用经过热预处理的石墨烯片以及由维生素C（抗坏血酸）和氢氧化钠（NaOH）组成的环保水相电解质。在石墨电极上施加+10 V的直流电位会引发水电解，在阳极和阴极产生反应性离子物种。
在阳极发生水的氧化反应：2H2O → O2+ 4H++ 4e?；ΔG° = +237.2 kJ mol?1。
在阴极发生水的还原反应：4H2O + 4e?→ 2H2+ 4OH?；ΔG° = -237.2 kJ mol?1。
阴极产生的氢氧根离子在电场作用下向阳极迁移，并插层到石墨烯片预先通过可控热处理（约600 °C持续2分钟）引入的缺陷富集位点。这些边缘和空位区域作为反应中心，使得OH–能够驱动亲核攻击和局部氧化。
电化学剥离的进行伴随着静电排斥和氧功能化基团插入引起的化学应变共同克服层间范德华相互作用（约0.31 eV/原子）的能量势垒。表面氧化反应导致在石墨烯的基面和边缘形成羟基（C–OH）、羰基（C=O）和羧基（–COOH）等官能团。维生素C（相对于标准氢电极的氧化还原电位为–0.39 V）扮演着温和还原剂和氧化还原缓冲剂的双重角色，通过稳定剥离过程中形成的自由基中间体来调节氧化动力学，从而防止过度氧化并保留对量子限域和荧光至关重要的石墨核。电解质中NaOH的浓度通过控制pH值，进而影响OH–离子的生成速率和迁移率，起着关键作用。优化的碱性环境有利于可控的插层和氧化，而过高的氢氧化物浓度则可能导致结构过度破坏。因此，微调阴离子浓度对于最大化GQD产率、荧光效率和胶体稳定性至关重要。
现有绿色合成策略的比较评估
GQDs的制备工艺除了光物理性质外，其可扩展性、安全性和生物相容性对于生物医学应用的发展也至关重要。与传统方法（如酸介导的氧化切割、柠檬酸热解或生物质衍生的自下而上合成）相比，本研究采用的维生素C辅助的电化学剥离法将反应时间显著缩短至15分钟，消除了有毒试剂，并且无需后续功能化即可实现高胶体稳定性和本征荧光。对比分析表明，该方法在生物相容性、工艺时长、表面官能团控制和体内就绪度等多个关键特征上优于多种常用技术。维生素C不仅作为生物相容性还原剂，还调节自由基生成，减少过度氧化，保护光致发光所需的石墨域。简单的24小时透析即可得到适合直接生物应用的无毒分散体。该策略结合了定量的体内毒性评估、荧光成像和肿瘤控制研究，是少数几个已证明具有临床前潜力的绿色GQD平台之一。
材料与表征
实验材料包括购自Graphenea Inc.的高纯度石墨烯片，以及Sigma-Aldrich提供的抗坏血酸和氢氧化钠。人乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231购自印度国家细胞科学中心。细胞培养试剂和生物学检测试剂盒均来自知名供应商。
GQDs的合成首先对石墨烯片进行氮气氛围下600 °C持续2分钟的热预处理以引入结构缺陷。随后，将预处理后的石墨烯片作为阳极和阴极，浸入含有0.1 M抗坏血酸和0.3–0.5 M NaOH的Milli-Q水电解质中。使用电化学工作站施加+10 V恒电位进行15分钟的 chronoamperometry 测量。电解液颜色从无色变为淡黄色表明GQDs形成。反应后的分散液经过离心、0.22 μm滤膜过滤和3.5 kDa分子截留量的透析膜透析24小时，以去除盐分和小分子杂质。
GQDs的生物相容性和细胞摄取使用小鼠成纤维细胞L929进行评估。MTT法检测显示，在5 μg/mL至0.1 mg/mL的浓度范围内处理24小时后，细胞存活率均超过80%，表明GQDs对正常细胞无毒性。对于MDA-MB-231细胞的摄取研究，细胞经不同浓度GQDs处理24小时后，通过共聚焦激光扫描显微镜观察。结果显示绿色荧光信号呈浓度依赖性增强，表明GQDs被有效内化，主要定位于细胞质，未进入细胞核。定量平均荧光强度分析证实了剂量依赖性的摄取增加。
细胞内活性氧（ROS）检测使用DCFDA染色结合流式细胞术进行。与未处理的对照组相比，GQDs处理组的DCF阳性细胞平均荧光强度（MFI）从8.3%显著升高至13.6%，表明纳米颗粒暴露诱导了细胞内ROS水平的升高。
表征仪器包括高分辨率透射电子显微镜、原子力显微镜、X射线衍射仪、傅里叶变换红外光谱仪、紫外-可见分光光度计、荧光分光光度计、动态光散射仪、共聚焦显微镜等。
体内生物分布、肿瘤模型和毒性评估
所有动物实验均遵循国家伦理指南，并获得Vellore Institute of Technology机构动物伦理委员会的批准。建立雌性BALB/c小鼠的4T1原位乳腺肿瘤模型。待肿瘤体积达到约80–100 mm3后，通过尾静脉注射GQDs。通过IVIS Spectrum系统进行活体荧光成像，并在不同时间点处死小鼠，收取主要器官进行离体荧光成像，以评估GQDs的生物分布。结果显示，GQDs在肿瘤部位有显著蓄积，并在24小时达到峰值，同时也在肝脏和肾脏中观察到较高信号，表明其通过EPR效应被动靶向肿瘤并可能通过肾脏清除。
对于毒性研究，小鼠随机分为对照组和GQDs处理组。GQDs隔天静脉注射，持续14天。期间监测小鼠一般行为和体重。第15天，收集血液进行血清生化分析和全血细胞计数，并收取主要器官进行苏木精-伊红染色组织病理学检查。结果表明，GQDs处理组小鼠的体重保持稳定，血液生化指标和血常规参数与对照组无显著差异，组织病理学检查未发现炎症、坏死或组织损伤迹象，证实了GQDs的系统生物相容性。
结果与讨论
GQDs合成过程中的视觉变化显示，电解液从初始的无色透明伴有黑色石墨棒，转变为剥离后的黄褐色，表明成功氧化并破碎成纳米级GQDs。在环境光下分散体保持黄褐色，而在365 nm紫外光照射下发出强烈的绿色荧光，证实了光致发光GQDs的形成。
原子力显微镜和透射电子显微镜表征显示，合成的GQDs横向尺寸在2–12 nm之间，厚度在0.8–2.6 nm（对应1-3层石墨烯），尺寸分布均匀，高分辨TEM图像显示出0.21 nm的晶格条纹，对应于石墨烯的（100）晶面，选区电子衍射图样也证实了其石墨晶体结构。
拉曼光谱显示在1347 cm–1（D带，源于缺陷）和1586 cm–1（G带，源于sp2碳）处有特征峰，ID/IG强度比约为1.12，表明存在丰富的边缘态和缺陷位点。傅里叶变换红外光谱确认了GQDs表面存在O–H、C≡C、C=C以及C–O等含氧官能团。紫外-可见吸收光谱在265 nm处有一个尖锐的吸收峰，归属于芳香sp2碳网络的π→π*电子跃迁。光致发光激发光谱在390–440 nm范围内有激发峰，归因于边缘态发射和富氧表面缺陷。X射线光电子能谱分析表明GQDs主要由碳和氧元素组成，高分辨率C 1s谱可分解为C–C/C=C、C–O、C=O和O–C=O等组分，证实了部分氧化和表面功能化。量子产率估计约为16–17%。X射线衍射图谱显示在2θ ≈ 24.8°处有一个宽化的衍射峰，对应于石墨碳的（002）面，表明结晶度降低和纳米尺度域尺寸。Zeta电位测量值为-28.3 mV，表明其在水分散体中具有优异的胶体稳定性，这归因于表面丰富的带负电的含氧官能团。GQDs表现出典型的激发依赖性发光行为，随着激发波长从350 nm增加到470 nm，发射峰位发生红移，强度逐渐减弱，这源于量子限域效应和表面缺陷态的共同作用。
生物相容性和细胞毒性评估显示，GQDs对L929正常成纤维细胞即使在100 μg/mL浓度下也保持高细胞存活率（>80%）。然而，对MDA-MB-231癌细胞则表现出剂量依赖性的细胞毒性，在50 μg/mL浓度下细胞存活率降至约42%。这种选择性毒性归因于GQDs在癌细胞内诱导产生活性氧，引发氧化应激，进而导致线粒体膜电位去极化、细胞色素c释放，激活caspase级联反应，最终诱发细胞凋亡。共聚焦显微镜观察证实GQDs能被MDA-MB-231细胞有效摄取，且呈浓度依赖性，主要定位于细胞质。流式细胞术检测ROS进一步验证了GQDs处理可引起细胞内ROS水平显著升高。
体内生物分布和抗肿瘤评价表明，静脉注射GQDs后，活体荧光成像显示肿瘤部位信号在24小时内逐渐增强，表明其具有良好的肿瘤靶向性。离体器官成像显示GQDs主要分布在肿瘤、肝脏和肾脏。治疗实验表明，GQDs处理能显著抑制4T1肿瘤的生长，且对小鼠体重、血液生化指标和主要器官组织结构均无显著不良影响，证明了其良好的体内安全性和治疗潜力。
结论
本研究成功开发了一种绿色、可扩展且经济可行的电化学方法，利用维生素C作为生物相容性剥离剂，从富含缺陷的石墨烯片制备GQDs。所得GQDs具有明亮的绿色光致发光、激发依赖性发射、高水分散性和胶体稳定性。生物学实验证明其对正常细胞毒性低，并能选择性诱导癌细胞产生ROS介导的凋亡。体内实验证实了其肿瘤靶向能力、成像潜力及系统生物相容性，在4T1荷瘤小鼠模型中显示出显著的肿瘤生长抑制效果且无可见器官损伤。这些发现验证了维生素C介导合成的GQDs作为一种多功能、生物安全的平台，在癌症纳米医学，特别是三阴性乳腺癌的诊疗一体化中具有广阔的转化应用前景。
