《Journal of the American Chemical Society》：Discovery of Supra-Bivalent GSK3β Inhibitory Peptides Containing an ATP-Mimetic Amino Acid
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本刊推荐：研究者创新性地将ATP模拟氨基酸Z整合至大环肽库，通过RaPID系统筛选出超高亲和力、高选择性的GSK3β抑制肽。结构解析揭示其通过"超双价"结合模式（同时占据ATP口袋、底物结合区及新型疏水口袋），突破了传统激酶抑制剂选择性瓶颈，为靶向GSK3β相关疾病（如结直肠癌）提供了新策略。
RaPID Selection against GSK3β
为构建含ATP模拟"弹头"氨基酸的大环肽库，研究团队基于已知GSK3β小分子抑制剂（如含氨基嘧啶基团的CHIR99201）设计了新型非天然氨基酸Z（对-(嘧啶-2-基氨基)苯丙氨酸）。该氨基酸可模拟ATP与激酶铰链区V135形成双氢键。通过柔性体外翻译（FIT）系统，将Z掺入由d-Tyr和Cys形成硫醚键的大环肽库中，环化结构增强肽的构象刚性和代谢稳定性。
经过五轮RaPID筛选（图2a），第五轮cDNA回收率与阳性/阴性比趋于稳定。下一代测序（NGS）分析显示，99.85%的序列含至少一个Z，92.3%的序列环大小超过13个氨基酸。UMAP降维和HDBSCAN聚类发现序列主要聚集为两类：含"ZRZNV"和"ZRZXXS"基序的簇群（图2c）。由于收敛性不足，研究团队进一步采用"亲和力平衡筛选"策略。
Affinity-Based Equilibrium Selection
该策略使mRNA展示肽库与固定化GSK3β在室温下平衡3小时，通过NGS分析结合与非结合组分，计算各肽的富集分数log2Y。结果显示，297种肽的log2Y >4（结合组分富集>16倍），而170种肽log2Y < -4。log2Y与结合自由能（ΔG）呈正相关，证实其可有效区分高亲和力配体（图4b）。
Synthesis and Biochemical Characterization of Discovered Peptides
选取15种log2Y值不同的肽进行固相合成。表面等离子共振（SPR）检测显示，所有肽与GSK3β的解离常数（KD）均低于微摩尔级，其中BiS3、5和8的KD达亚纳摩尔级（图4a）。ADP-Glo激酶实验表明，BiS3对GSK3β的半数抑制浓度（IC50）为4.8 nM，且对同源激酶GSK3α的选择性达3.9倍（IC50= 18.4 nM）。在50 nM浓度下，BiS3对CMGC家族激酶（ERK2、JNK1/3、p38α/β/γ/δ）几乎无抑制，即使在1 μM时仅JNK3被部分抑制（62%），展现出卓越选择性（图4d）。
将BiS3中的Z突变为苯丙氨酸（F）后，Z5F和Z7F突变体活性降低>100倍，而Z12F突变无影响，证实ZRZ基序中前两个Z对抑制活性关键（图4e）。
Structural Characterization of GSK3β Inhibition by Peptides
六种肽（BiS1-5和8）与GSK3β的共晶结构（分辨率1.39-2.07 ?）显示，激酶处于活性构象（αC螺旋内收，DFG基序为"in"状态）。所有肽的ZRZ基序与周围残基（对应BiS3的S4-C13）主干原子高度叠合（RMSD 0.151-0.309 ?），表明结合模式一致（图5b）。
重点分析BiS3复合物：Z7与V135主干形成双氢键，模拟ATP腺嘌呤的结合（图5d-f）；R6通过氢键稳定Z7构象，并与Q185、N186、D200等催化关键残基相互作用，模拟ATP-Mg2+结合模式。此外，R6和F8与GSK3β的I62、N64形成反平行β片层，进一步锚定肽段（图5g）。
独特的是，ZRZXXS基序形成"knob-into-hole"结构，容纳R141胍基（图5h）：Z5嘧啶环和Z7主干与R141形成氢键，S10侧链与Z12酰胺基团形成分子内氢键，稳定β转角构象。该相互作用与GSK3β特有的疏水口袋（由V142、Y146、Y157、P191组成）结合（图5i），可能贡献于选择性。由于同时占据ATP位点、底物结合区及新型口袋，此类肽被定义为"超双价"抑制剂。
Cellular Activity of Supra-Bivalent Peptides
在HCT116结直肠癌细胞中，单独使用肽未显抑制活性，而小分子抑制剂9-ING-41有效。通过细胞穿膜肽（CPP）cR10（环化d/l-十精氨酸）递送后，多数肽在10 μM内呈剂量依赖性抑制细胞活力，且乳酸脱氢酶（LDH）释放率<25%，表明毒性可控（图S32b）。需进一步验证胞内GSK3β特异性抑制机制。
Discussion and Conclusion
本研究通过整合ATP模拟氨基酸Z的RaPID平台，突破了传统双价抑制剂需预知靶点结构的限制。log2Y评分系统可高效筛选高亲和力配体。结构生物学揭示的"超双价"结合模式（ATP位点模拟+底物竞争+新型口袋占据）为设计高选择性激酶抑制剂提供了新范式。后续通过骨架修饰（如N-甲基化）或缩短肽长可能优化膜透性，推动其向治疗应用转化。
