《Nanoscale》：Hijacking exosome biogenesis: viral glycoproteins as modular scaffolds for engineering functionalized extracellular vesicles
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本文系统探讨了多种病毒包膜糖蛋白（GPs）通过劫持内源性外泌体生物发生途径，高效整合到小细胞外囊泡（sEVs）膜上的分子机制。研究证实跨膜区（TMH）和胞质尾端是sEV靶向的关键决定域，而VSVG修饰的sEVs展现出2倍以上的细胞摄取增强。该策略为开发靶向性sEV疗法（如肿瘤、神经疾病治疗）提供了模块化工程平台。
引言
细胞外囊泡（EVs）是一类参与免疫调节、炎症反应、癌症进展等生理病理过程的膜包被纳米颗粒。其中，小细胞外囊泡（sEVs）因其纳米尺寸、低免疫原性和跨生物屏障能力，成为精准药物递送的有前景平台。病毒包膜糖蛋白（GPs）作为介导病毒-宿主细胞相互作用的关键分子，其跨膜拓扑结构（包括信号肽、胞外域、跨膜螺旋和胞质尾端）与sEV膜整合具有天然兼容性。本研究通过构建VSVG、HSV-gpB、SARS-CoV-1刺突蛋白和RD114A等多种病毒GPs的荧光报告基因融合载体，系统解析了其劫持sEV生物发生途径的分子机制。
材料与方法
实验采用人293T细胞系，通过脂质体转染或稳定株筛选（嘌呤霉素筛选）表达GP融合蛋白。sEVs通过超速离心结合ExoQuick TC试剂沉淀分离，并利用纳米颗粒追踪分析（NTA）、免疫斑点印迹和冷冻电镜进行表征。共定位分析采用CD63/XPACK等sEV标志物与GP-RFP/GFP共转染，通过共聚焦显微镜计算皮尔逊相关系数。sEV摄取实验通过流式细胞术和EndoTracker/LysoTracker标记内吞途径评估。
结果
病毒GPs的sEV膜整合机制
活细胞共聚焦成像显示，所有测试的GPs均主要定位于胞内囊泡状结构（箭头指示），与CD63/XPACK标志物高度共定位（皮尔逊系数0.75–0.88）。值得注意的是，截断GPs胞外域（仅保留SP-TMH-胞质尾端）的构建体（如tVSVG-GFP）仍能高效靶向sEVs，表明跨膜区和胞质尾端是sEV分选的核心决定因素。进一步将VSVG胞外域替换为高斯荧光素酶（gLuc）-铰链区融合蛋白（gLuc-tVSVG-GFP）后，仍保持与CD63/XPACK的高共定位（皮尔逊系数分别为0.911和0.722），证实该区域可作为模块化支架展示外源功能蛋白。
sEVs的理化特性与功能验证
NTA分析显示GP修饰sEVs的粒径分布为81–94纳米，符合典型sEVs特征。免疫斑点印迹验证了CD63、CD81、ALIX等sEV标志物阳性，且高尔基体标志物GM130阴性，确保囊泡纯度。功能实验表明，VSVG修饰sEVs在受体细胞中的摄取量较未修饰组显著提升（流式检测48小时增强约2.33倍），且内化后主要进入内体-溶酶体途径（EndoTracker/LysoTracker共定位）。截断胞外域的VSVG-sEVs摄取能力大幅下降，提示胞外域介导特异性内化。
讨论
本研究揭示了病毒GPs通过内吞运输途径劫持sEV生物发生机器的保守机制。跨膜/胞质尾端驱动的sEV靶向特性为工程化设计提供了模块化基础，即可保留GP的膜锚定功能，同时替换胞外域以定制靶向性（如SARS-CoV-1刺突靶向ACE2+细胞）。VSVG-sEVs展现的增强内化能力为神经疾病、癌症靶向治疗提供了新思路。未来需在体内模型中评估GP-sEVs的靶向效率与免疫原性，推动其临床转化。
结论
病毒GPs作为天然优化的膜工程工具，为sEVs表面功能化提供了高效、可编程的策略。该研究不仅深化了对病毒-宿主囊泡通路互作的理解，也为开发下一代病毒仿生sEV疗法奠定了分子基础。
