基于PMA-ddPCR技术的植物乳杆菌YZH81菌株特异性定量检测方法及其在发酵乳品质控制中的应用研究

《Journal of Dairy Science》：Development of a propidium monoazide–droplet digital polymerase chain reaction assay for strain-specific quantification of Lactiplantibacillus plantarum YZH81 in fermented milk

本研究针对发酵乳中益生菌功效具有菌株特异性但缺乏精准定量方法的行业难题，开发了基于全基因组SNP分析的PMA-ddPCR检测技术。通过设计TaqMan-MGB探针，建立了能够特异性识别植物乳杆菌YZH81活菌的定量方法，检测限达102cfu/mL，在104-107cfu/mL范围内实现准确定量。该技术为益生菌发酵乳的质量控制和功能验证提供了创新解决方案。

　　

在健康意识日益增强的今天，发酵乳作为富含益生菌的功能性食品备受消费者青睐。然而市场上琳琅满目的益生菌发酵乳产品背后，隐藏着一个行业痛点：益生菌的功效具有严格的菌株特异性，但现有的检测标准仅要求测定乳酸菌总数，无法实现特定功能菌株的精准识别和定量。这就导致产品宣称的功能与实际效果之间可能存在差距，既不利于行业规范发展，也影响了消费者的权益保障。

传统微生物培养方法虽然特异性高，但耗时漫长；分子检测技术如实时荧光定量PCR(qPCR)虽速度较快，却在菌株区分精度和活菌鉴别能力上存在局限。更为关键的是，现行国家标准(GB 4789.35-2023)和国际标准(ISO 7889)都未对菌株水平的检测提出要求，这使得开发能够实现菌株特异性活菌定量的新技术成为行业迫切需求。

针对这一技术瓶颈，南京师范大学食品科学与制药工程学院的研究团队在《Journal of Dairy Science》上发表了一项创新研究成果。该研究以实验室自主分离保藏的植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)YZH81为研究对象，这是一种具有高产胞外多糖和降胆固醇特性的潜在益生菌株。研究人员成功开发了碘化丙啶单氮唑(Propidium Monoazide, PMA)与微滴式数字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)相结合的新型检测方法，实现了发酵乳中YZH81活菌的特异性精准定量。

关键技术方法包括：基于全基因组测序(Whole Genome Sequencing, WGS)和单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)分析设计菌株特异性引物和探针；通过珠磨法制备膜损伤菌体以优化PMA处理条件；建立PMA-ddPCR标准曲线并验证其在人工污染发酵乳样品中的检测性能。研究选取了4种市售发酵乳产品作为样本基质，系统评估了方法的适用性。

设计针对L. plantarum YZH81的菌株特异性引物和探针

研究人员通过比较基因组分析，对YZH81和19个其他植物乳杆菌菌株的gyrA基因进行比对，发现了一个YZH81特有的SNP位点(C→T)。利用这一独特遗传标记，他们设计了TaqMan-MGB探针和引物，并构建了包含75个乳酸菌菌株的系统发育树，证实了gyrA基因在物种水平的特异性。该探针能够精确区分YZH81与其他密切相关的植物乳杆菌菌株。

针对SNP位点的引物和探针特异性测试

特异性验证实验表明，设计的引物和探针仅对YZH81产生特异性扩增，而对其他植物乳杆菌菌株(WCFS1、ZHR9、ST-III、ATCC 8014)以及鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)等常见发酵乳益生菌均无交叉反应。ddPCR分析进一步证实了该检测系统的菌株水平特异性。

qPCR和ddPCR灵敏度的测定

灵敏度比较显示，ddPCR的检测限达到10²cfu/mL，显著优于qPCR的10⁴cfu/mL。标准曲线分析表明ddPCR具有更好的线性关系(R²=0.9914)，在细菌浓度与拷贝数之间建立了可靠的数量关系。

抗干扰能力的测定

在含有10⁵cfu/mL非目标菌的混合细菌悬液中，该方法仍能准确量化YZH81，检测限保持不变，证明其在实际复杂样品基质中的稳定性。

膜损伤细菌制备方法的建立

研究采用珠磨匀质化方法制备膜损伤菌体，发现35个匀质化循环可有效灭活YZH81，为PMA处理提供了理想的实验材料。

最佳PMA浓度的确定

通过测试不同PMA浓度对活菌和膜损伤菌的影响，确定20μM为最佳工作浓度。该浓度能有效抑制死菌DNA扩增，同时不影响活菌检测。

PMA-ddPCR标准曲线

建立的PMA-ddPCR标准曲线在10²-10⁷cfu/mL范围内呈现良好线性，回收率在52%-81%之间，满足定量分析要求。

人工污染样品中L. plantarum YZH81的定量检测

在4种市售发酵乳的人工污染样品中，PMA-ddPCR成功检测到低至10¹cfu/mL的YZH81。在10⁴-10⁷cfu/mL范围内，检测结果与理论值高度吻合，相对标准偏差(RSD)均低于25%，表明方法具有良好的重现性。

该研究的创新性在于首次将WGS-SNP分析与PMA-ddPCR技术相结合，实现了发酵乳中特定植物乳杆菌菌株的活菌定量。与传统培养方法相比，新方法不仅大大缩短了检测时间，还提供了菌株水平的分辨能力。更重要的是，该方法能够有效区分活菌和死菌，解决了常规PCR方法无法判断菌体活性的难题。

在讨论部分，研究人员强调了该技术的实际应用价值。目前发酵乳市场普遍采用多菌株配方来增强产品功能性，但菌株间生理特性和功能稳定性的差异，加上缺乏精确的菌株水平鉴定技术，严重制约了质量控制和功能标准化。本研究建立的检测方法为解决这一行业难题提供了技术支撑，有助于推动益生菌发酵乳产品的质量标准化和功能真实化。

值得注意的是，该方法不仅适用于发酵乳基质，还具有向其他复杂生物样本扩展应用的潜力。例如，可用于实验室动物肠道样本中目标菌株的追踪定位，或在传统发酵食品(如泡菜、发酵肉制品)中精确鉴定优势菌群，为益生菌资源的开发利用提供技术支持。

综上所述，这项研究开发的PMA-ddPCR检测技术为益生菌发酵乳的质量控制提供了创新解决方案，填补了菌株特异性活菌定量检测的技术空白。通过实现特定功能菌株的精准识别和定量，该技术有望促进益生菌行业的规范发展，保障产品质量，最终惠及消费者健康。随着精准营养概念的深入，这种菌株水平的检测方法将在功能食品开发和个性化营养方案制定中发挥越来越重要的作用。