同一轴向上从甲硫氨酸到组氨酸的突变对1型铜蓝蛋白光谱性质产生不同影响的结构基础

《Journal of Inorganic Biochemistry》：Structural basis for different effects on spectroscopic properties of type 1 copper azurin by the same axial methionine to histidine mutation

本研究通过UV-Vis、EPR和X射线晶体学，比较了铜蛋白M121H突变体在Pseudomonas aeruginosa和Alcaligenes denitrificans中的光谱和结构差异，揭示了配位环境变化对电子结构的影响，为金属蛋白设计提供依据。

　　

Jiaqing Xu|Lu Yu|Sheng-Song Yu|Yiwei Liu|Jing-Xiang Wang|Jun-Jie Li|Casey Van Stappen|Han-Qing Yu|Mark J. Nilges|Yi Lu

德克萨斯大学奥斯汀分校化学系，美国德克萨斯州奥斯汀市24街东105号，邮编78712

摘要

铜氧化还原蛋白是一类铜蛋白，它们在关键生物过程中介导电子转移。了解决定其光谱特性的结构特征对于阐明结构-功能关系非常重要。在这里，我们通过紫外-可见光谱（UV–Vis）、电子顺磁共振（EPR）光谱和X射线晶体学研究了铜绿假单胞菌（M121HAz-PA）中轴向甲硫氨酸突变为组氨酸对光谱特性的影响，以探讨这种突变与其在反硝化藻菌（M121HAz-AD）中的同源蛋白的不同影响。M121HAz-PA在pH 4到pH 8的范围内表现出pH依赖性的紫外-可见光谱变化，并具有不寻常的EPR特征，表明其配位电子结构发生了变化。叠氮化物结合滴定产生的EPR光谱介于T1Cu和T2Cu之间，这支持了（外源）配体配位的变化驱动了显著的几何和电子重排。X射线晶体学揭示了M121HAz-PA和M121HAz-AD中轴向His121与Cu^II的配位模式以及它们之间的取向差异，为观察到的光谱差异提供了结构基础。这些发现揭示了配体配位的微妙变化如何影响铜结合位点的电子结构，为金属蛋白的合理设计提供了依据。

引言

单核铜氧化还原蛋白是一类含有铜中心的氧化还原活性蛋白，在从光合作用到呼吸作用等许多关键生物过程中发挥着重要的电子转移（ET）作用[[1], [2], [3], [4], [5]]。这类蛋白中最常见的成员是1型铜（T1Cu）或蓝色铜蛋白，它们包含一个由一个S_Cys和两个N_His在三角平面上配位的铜中心，以及一个或两个轴向相互作用——通常是在平面上方的甲硫氨酸，在某些情况下，平面上方还有额外的轴向相互作用，这些相互作用进一步调节了铜位点的几何和电子结构[[6], [7], [8], [9]]。

1型铜蛋白的一个典型例子是铜绿假单胞菌（PA）和反硝化藻菌（AD）中的蓝蛋白（Azurin）。它的三角几何结构使得Cu^II的$d_{x^2?y^2}$_Cys的p_π轨道重叠，从而在大约600纳米处产生强烈的S_π(Cys)-Cu^II配体-金属电荷转移（LMCT）带，这是它们特征性蓝色颜色的原因[[10], [11], [12]]。Cu^II态在电子顺磁共振（EPR）光谱中也表现出相对较弱的平行超精细耦合（A_||??4?cm^?1），这种耦合可以是轴向的（g_z?>?g_y?≈?g_x）或菱形的（g_z?>?g_y?>?g< />），反映了高度共价的Cu-S_Cys相互作用[[12], [13], [14], [15], [16]]。相比之下，大多数2型铜（T2Cu）和一些具有强轴向配体的工程化蓝蛋白表现出四方几何结构，使得Cu主要与Cys的p_σ轨道重叠。因此，在大约400纳米处观察到更强的S_σ(Cys)-Cu^II LMCT，并且平行超精细耦合常数较大（A_||?>?150?×?10^?4?cm^?1)[[17], [18], [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25], [26], [27]]。

为了理解决定这些光谱特性的结构特征，人们对蓝蛋白和其他单核铜氧化还原蛋白中T1Cu中心的一级和二级配位球（PCS和SCS）中的残基进行了突变研究，包括将轴向甲硫氨酸突变为许多其他残基[26,[28], [29], [30], [31], [32], [33], [34], [35], [36], [37], [38], [39], [40], [41], [42]]。在轴向甲硫氨酸突变中，突变为组氨酸是一个有趣的例子，因为它可能为T1Cu中心提供更强的配体[[33], [34], [35], [36], [37], [38]]。为此，我们准备了来自反硝化藻菌（M121HAz-AD）的M121HAz，并通过UV–vis、EPR光谱方法以及X射线晶体学对其进行了表征[[34], [35], [36], [37]]。相比之下，铜绿假单胞菌（M121HAz-PA）中的相同突变研究较少，且尚未报道M121HAz-PA的EPR或结构[33,38]。来自不同生物的同源铜氧化还原蛋白由于序列和微环境差异可能表现出不同的物理化学性质[36,[43], [44], [45], [46], [47], [48], [49], [50]]。比较相同突变对不同物种同源蛋白的光谱特性的影响可以提供关于序列和金属配位变化如何影响蛋白功能的关键见解。因此，我们在本文中介绍了M121HAz-PA的光谱和结构特征，并将其与反硝化藻菌（M121HAz-AD）中的同源蛋白进行了比较。我们发现，相同的M121H突变对紫外-可见光谱吸收和EPR光谱特性有不同的影响。我们还获得了M121HAz-PA的X射线晶体结构，并将其与M121HAz-AD的结构进行了叠加，为理解这些差异提供了结构基础。

章节片段

紫外-可见光谱：pH依赖性的电荷转移特征

我们使用先前报道的方案[51,52]构建、表达并纯化了M121HAz-PA。蛋白质的 electrospray 离子化质谱分析显示了一个质量为13,948 Da的单一峰（图S1），这与无铜 apo-M121HAz-PA的计算质量（13,949 Da）在实验误差范围内一致，表明成功表达了无铜的 apo-蛋白。

当向无色的 apo-M121HAz-PA 中加入 CuSO₄ 时，会出现强烈的绿色

结论

总之，我们证明了同源单核铜氧化还原蛋白中相同的轴向突变到组氨酸会导致明显的pH依赖性紫外-可见光谱和EPR光谱差异，这些差异可归因于组氨酸配体取向和Cu^II-N_His配位模式的变化。具体来说，我们发现Cu^II-M121HAz-PA在其紫外-可见光谱中的变化较小，而Cu^II-M121HAz-AD则表现出更多的菱形EPR特征。

材料与方法

蛋白质表达与纯化。我们使用先前报道的方案[51]进行了M121HAz-PA的构建、表达和纯化。在LB培养基中培养了8 mL含有M121HAz-PA质粒的大肠杆菌 BL21 (DE3) 细胞8小时，温度为37°C，然后将其接种到含有50 mg/L卡那霉素的1.5 L 2×YT培养基中。培养物在25°C下孵育约15小时，直到OD₆₀₀达到约0.8。随后在30°C下用IPTG（75 mg/L）诱导4小时。细胞

CRediT作者贡献声明

Jiaqing Xu：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，可视化，研究，正式分析，数据管理，概念化。Lu Yu：撰写 – 原始草稿，可视化，研究，正式分析，数据管理。Sheng-Song Yu：撰写 – 原始草稿，可视化，研究，正式分析，数据管理。Yiwei Liu：撰写 – 审稿与编辑，可视化，正式分析。Jing-Xiang Wang：撰写 – 审稿与编辑，可视化，正式分析，

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本工作得到了美国国家科学基金会（CHE-2420683）的支持。我们还要感谢Robert A. Welch 基金会（F-0020）对 Lu 团组研究的支持。C.V.S. 还感谢美国国立卫生研究院（F32GM145134）的支持。EPR 测量在伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校的伊利诺伊 EPR 研究中心进行。晶体学测量在上海同步辐射设施的 BL19U1 光束线上进行。