《Transboundary and Emerging Diseases》：Design of B-Cell Multi-Epitope Subunit Vaccines Against Glaesserella parasuis by Reverse Vaccinology: An In Silico and In Vivo Study
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本文介绍了一种通过反向疫苗学与免疫信息学技术设计的抗副猪格拉瑟氏菌(GPS)多表位疫苗鸡尾酒(MEVC)。研究基于GPS六种外膜抗原的14个B细胞表位构建了三个多表位亚基(TB/14B/24B)，经生物信息学验证显示其具有高抗原性、可溶性及稳定性。小鼠攻毒实验表明MEVC联合Gel-01佐剂对GPS5血清型攻击提供80%保护率，显著提升抗原特异性IgG水平，为防控猪格拉瑟病提供了新型疫苗候选方案。
引言
副猪格拉瑟氏菌(Glaesserella parasuis, GPS)是引起猪格拉瑟病的革兰氏阴性菌，全球范围内导致养猪业重大经济损失。现有灭活疫苗存在血清型特异性保护局限，而亚单位疫苗的效力高度依赖抗原选择。本研究采用反向疫苗学策略，基于六种GPS外膜抗原（OmpP2、TbpA、HxuC、TolC、MreC、PilB）开发多表位疫苗鸡尾酒(MEVC)，旨在突破传统疫苗限制。
疫苗设计方法
通过TMHMM和SignalP5.0服务器预测抗原蛋白的跨膜区和信号肽，利用ABCPred和BepiPred-2.0筛选B细胞表位。最终从31个候选表位中优选13个高抗原性（VaxiJen评分>0.4）、无过敏原性（AllerTOP v.21验证）且无毒性（ToxinPred评估）的表位，通过KK或GPGPGLRMKLPKS连接子构建三种多表位亚基（MESs）：TB（153个氨基酸）、14B（136aa）和24B（332aa）。理化性质分析显示三者分子量分别为17.43kDa、15.04kDa和34.02kDa，不稳定指数除14B（>40）外均低于40，表明具有良好稳定性。
结构验证与分子对接
二级结构预测（PSIPRED/SOPMA）显示TB以α螺旋（26.62%）和无规则卷曲（51.3%）为主，24B则富含卷曲结构（70.77%）。三级结构经I-TASSER建模、GalaxyRefine优化后，通过ProSA-web验证Z值（TB:-2.11；14B:-3.45；24B:-2.27），Ramachandran图显示≥96.6%残基位于允许区。分子对接（HawkDock服务器）表明MESs与猪白细胞抗原（SLA-DQ）结合稳定，其中TB-SLA复合物形成3个盐桥、194个非键接触，MM/GBSA计算结合自由能证实强相互作用。
免疫模拟与实验验证
C-ImmSim免疫模拟预测疫苗可激发强烈体液免疫（IgG/IgM水平显著升高）和细胞免疫（Th/Tc/NK细胞活化）。实验层面，将合成基因克隆至pET32a载体，于E.coli BL21(DE3)中诱导表达，镍柱纯化后通过SDS-PAGE和Western blot（抗His标签抗体）验证蛋白纯度。小鼠实验显示，MEVC（TB+14B+24B）+ Gel-01佐剂组攻毒后存活率达80%，显著高于PBS组（20%）和灭活疫苗组（40%）。ELISA检测证实二次免疫后抗原特异性IgG滴度极显著上升（p<0.0001）。
讨论与展望
本研究创新性地将VacJ蛋白与MESs联用，但发现VacJ可能引发免疫显性优势，导致MESs表位应答被抑制。未来需优化表位组合与递送系统，并在猪体模型中验证交叉保护效果。该研究为开发广谱抗GPS疫苗提供了新范式。
结论
基于反向疫苗学设计的MEVC能有效激活体液与细胞免疫，对GPS5攻击提供80%保护率，具备成为抗猪格拉瑟病新型疫苗的潜力。
