《International Journal of Endocrinology》：Serum microRNA-126 Levels Are Associated With Diabetic Nephropathy in Patients With Type 2 Diabetes Mellitus
Abstract
Objective
糖尿病肾病（DN）在2型糖尿病（T2DM）患者中发生率近40%，且与终末期肾病风险呈正相关。探索新型生物标志物对DN的早期诊断和干预至关重要。鉴于microRNA-126（miR-126）可能与糖尿病发生相关，本研究旨在评估miR-126与DN之间的关联。
Methods
本研究采用前瞻性队列设计和巢式病例对照方法，共纳入300名受试者（100名T2DM患者、100名DN患者和100名健康对照）。通过实时定量PCR（qPCR）分析miR-126表达，并比较三组间差异。采用Kaplan–Meier分析展示总生存期（OS），利用曲线下面积（AUC）评估miR-126作为DN生物标志物的潜力。
Result
与T2DM患者和健康对照相比，DN患者的miR-126含量更低（p< 0.001），且miR-126水平随估算肾小球滤过率（eGFR）降低而显著下降（r?=?0.65, p< 0.001）。此外，血清miR-126水平四分位数组间的主要不良心脑血管事件（MACCE）无生存分布存在显著差异（趋势p< 0.001）。miR-126区分DN与T2DM患者的AUC为0.804（95% CI, 0.745–0.863），敏感性83.0%，特异性63.0%。
Conclusion
本研究证实，与健康志愿者相比，miR-126水平降低与DN发生风险增加相关。更重要的是，miR-126在区分DN与T2DM患者方面具有显著的诊断价值。
1. Introduction
糖尿病（DM）是一种以胰岛素分泌和作用缺陷为特征的慢性代谢性疾病。在众多DM相关并发症中，糖尿病肾病（DN）是导致终末期肾病（ESRD）的主要原因之一。约40%的DM患者并发DN，这进一步增加了DM患者的发病率和死亡率。在中国，DN带来了沉重的疾病负担。2017年，中国透析患者中超过20%患有糖尿病。此外，中国DN的全因死亡率增加了33.3%。这些挑战凸显了深入理解DN以遏制其流行的紧迫性。
葡萄糖代谢紊乱、氧化应激和炎症被认为是DN的主要病因，但其潜在机制尚不完全清楚。既往研究表明，伴有DN的T2DM患者高血压和电解质紊乱患病率显著更高，这些因素也可能促进T2DM向DN进展。通常，DN的诊断和严重程度评估依赖于肾脏活检样本的组织学改变以及实验室指标，如肾小球滤过率（GFR）、蛋白尿等。然而，肾脏活检是有创操作，且利用蛋白尿作为DN指标存在局限性。因此，寻找一种非侵入性生物标志物来反映DN的发病机制，以实现早期诊断和严重程度分层至关重要。
目前，新兴研究发现循环microRNAs（miRs）与DM相关，microRNAs在DN中的关键作用日益受到研究者关注。miR-126最初被报道与多种疾病有关，其功能障碍可导致严重的葡萄糖代谢受损。这些研究表明miR-126表达与葡萄糖稳态调节相关。DN被认为是糖尿病患者最常见的微血管并发症。据报道，伴有微血管并发症的DM患者中miR-126表达下调，通过VEGF/MAPK通路激活导致新生血管形成增加。此外，既往研究提示增强miRNA-126表达在T2DM患者中具有靶向氧化应激的治疗潜力。
然而，miR-126在罹患DN的T2DM患者中的诊断作用尚不清楚。因此，本研究旨在探讨miR-126在DN发生中的诊断价值及其与糖尿病危险因素和肾损伤标志物的关联。
2. Materials and Methods
2.1. Study Cohort
本研究为前瞻性队列设计和巢式病例对照研究，连续纳入2016年1月至2021年12月期间从黑龙江中医药大学附属第一医院肾病科招募的300名受试者。患者分为三组：T2DM伴DN组（DN组）、T2DM不伴DN组（DM组）和健康对照组（糖耐量正常者）。中位随访时间为42（14-60）个月。排除标准包括1型糖尿病、晚期慢性糖尿病并发症、肝损伤、风湿免疫系统疾病、癌症、心血管疾病以及其他疾病引起的肾病或肾炎。随访时间从入院日期开始，至死亡日期或末次随访日期结束。
糖耐量正常通过口服葡萄糖耐量试验（OGTT）评估。T2DM定义为空腹血糖（FPG）浓度≥200 mg/dL或正在接受降糖药物治疗。DN的定义为连续两次测量尿白蛋白与肌酐比值（男性>2.5 mg/mmol，女性>3.5 mg/mmol），或单次检测到蛋白尿且患者正在接受血管紧张素II受体拮抗剂治疗。
收集患者入院时的人口学特征和危险因素，包括年龄、性别、体重指数（BMI）和病史（高血压、吸烟状况）。同时记录他汀类药物、口服降糖药和胰岛素的使用情况。生化检测指标包括空腹血糖（FBG）、糖化血红蛋白（HbA1c）、肌酐（CR）、尿酸（UA）和估算肾小球滤过率（eGFR）。此外，还收集了低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）。eGFR通过基于肌酐的慢性肾脏病流行病学协作组（CKD-EPI）公式计算。本研究经黑龙江中医药大学附属第一医院伦理委员会批准，所有参与者在入组前均签署知情同意书。
2.2. Laboratory Measurements
入院后采集血样（5 mL），并转移至EDTA和柠檬酸盐抗凝管中。使用TRIzol LS试剂从0.3 mL血清中提取总RNA。通过实时定量聚合酶链反应（qPCR）评估miR-126水平。使用特异性TaqMan microRNA检测试剂盒对获得的cDNA进行扩增。
随后，使用ABI Prism 7500序列检测系统进行qPCR。扩增反应条件为：95°C孵育30分钟，随后进行40个循环（94°C 15秒，55°C 30秒，70°C 30秒）。根据循环阈值（Ct）法量化miR-126的表达水平。
2.3. Statistical Analysis
使用SPSS（版本22.0）和GraphPad Prism 8.00软件进行统计分析。偏态分布数据以中位数和范围表示，采用Mann–Whitney U检验和Kruskal–Wallis H检验进行分析。分类变量以百分比描述，组间比较采用χ2检验。采用Spearman等级相关分析miR-126表达与临床指标（如eGFR、HbA1c）的相关性。计算受试者工作特征曲线下面积（AUROC）以评估miR-126作为DN患者生物标志物的潜力。主要不良心脑血管事件（MACCE）定义为心绞痛、急性心肌梗死、心脏骤停、心律失常、心力衰竭、卒中、院内全因死亡率或任何组合。样本量计算基于对照组暴露率预期为25%、比值比为3.0的假设，设定α=0.05，效能=90%，病例对照比为1:1:1，需要70例DN病例、70例T2DM病例和70例对照。因此，本研究纳入300名参与者（100名非糖尿病健康志愿者、100名T2DM患者和100名DN患者）可满足研究需求。采用Kaplan–Meier法估计MACCE，并使用对数秩检验比较生存估计。p值< 0.05认为具有统计学显著性。
3. Results
3.1. Baseline Characteristics
共招募100名非糖尿病健康志愿者和200名参与者（包括100名T2DM患者和100名DN患者），中位随访时间为42个月。基线特征如表1所示。在所有纳入患者中，当前吸烟者分别为139名（46.3%）和110名（36.7%）。三组间在吸烟状况、高血压病史、HDL-C、LDL-C、TC、TG、性别和年龄方面均无显著差异（所有p> 0.05），而Cr、eGFR和HbA1c存在显著差异（所有p< 0.05）。
3.2. Stratified Analysis of miR-126 Among Groups and Correlation Analysis Related to Clinical and Pathological Parameters
DN患者和DM患者的血清miR-126水平均显著低于健康对照（所有p< 0.001）；此外，DN组与DM组之间也存在统计学显著差异（p< 0.001）。同时，观察到HbA1c≥6%异常患者的血清miR-126水平低于HbA1c正常者。相关性分析显示，miR-126水平与HbA1c呈负相关（r= -0.53, p< 0.001），而与eGFR呈正相关（r= 0.65, p< 0.001）。Kaplan–Meier生存分析显示，不同血清miR-126水平四分位数组间的MACCE无生存分布存在显著差异（对数秩检验，趋势p< 0.001）。
3.3. Diagnostic Potential of miR-126 Level in Patients With DN
ROC分析用于检验miR-126作为生物标志物区分DM患者与健康对照的潜力。AUC为0.872（95% CI, 0.831–0.913; p< 0.001），miR-126区分DM患者与健康对照的敏感性和特异性分别为91.0%和81.0%。更重要的是，miR-126在区分DN与DM患者方面也具有良好的诊断能力（AUC: 0.804, 95% CI: 0.745–0.863），敏感性为83.0%，特异性为63.0%。
4. Discussion
本研究旨在评估血清miR-126水平与DN之间的潜在关联。研究发现DN组血清miR-126水平显著降低，且与反映DN进展的Hb1Ac和eGFR水平相关，差异均具有统计学意义。因此，我们认为miR-126可能成为DN诊断的潜在生物标志物。
DN是DM的主要终末期并发症，发生于近40%的T2DM患者，且与终末期肾病风险呈正相关。目前，仍在探索合适的生物标志物以区分T2DM患者中的DN，从而最大程度地延缓ESRD的疾病进展。现有DN治疗策略多以减缓其进展为目标，但多数效果有限。因此，迫切需要探索新型生物标志物以促进DN的早期诊断和干预。大量研究表明，DN患者中存在某些microRNAs表达水平的改变。鉴于microRNA在DN中的关键作用日益凸显，本研究旨在评估miR-126在DN中的诊断作用。
MicroRNA在DN发展中的作用机制复杂且多向。近期研究表明氧化应激可能在T2DM的发病机制中起关键作用。高血糖水平通过调节糖酵解和晚期糖基化终末产物诱导氧化应激，而氧化应激在DM及其相关并发症的机制中也扮演重要角色。由于多种microRNAs被报道与DN发展相关，Akp?nar等人研究了10种microRNAs在区分150名DN患者与对照中的表达，提示这些miRNAs可能参与DN的发病机制。一些研究表明，伴有并发症的糖尿病组miR-21、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）和肾损伤分子-1（KIM-1）表达显著升高，这与内皮功能障碍和血管重塑相关。此外，既往数据还显示miR-29c的降低与T2DM患者炎症和氧化应激增加相关。
既往研究已证明miR-126对抗氧化应激的有益作用，它可以在缺氧条件下协调内皮祖细胞功能，并抑制缺血诱导的氧化应激和炎症。Ahmed等人报道，T2DM患者中miR-126、SPRED1和PI3K/Akt磷酸化表达降低。另一项研究表明，miR-126影响IRS1表达，导致PI3K/Akt通路蛋白表达下调，并抑制细胞侵袭和活力。此外，miR-126还调节PI3K/Akt通路中的下游基因PIK3R2，并在内皮祖细胞中促进肾小球和糖尿病创面修复。
总之，本研究结果可能反映了氧化应激（通过循环miR-126水平反映）在导致T2DM患者肾损伤的病理生理机制中的潜在作用。
本研究也存在若干局限性。首先，样本量相对较小，且所有患者均来自单中心观察性研究，可靠性和有效性有限。其次，这项单中心研究证明了miR-126与DN存在之间的关联，但无法推断因果关系，其在氧化应激背景下对DN发生发展的影响仍有待探索。
综上所述，本研究证实miR-126水平降低与DN发生风险增加相关。更重要的是，miR-126在区分DN与T2DM患者方面具有显著的诊断价值。基于当前数据，有助于认识到血清miR-126水平是DN发生风险的独立决定因素，并可被视为这些患者中具有独立诊断价值的有用生物标志物。然而，需要在更大规模、多中心队列中进行额外研究，以阐明miR-126在这些患者发病机制中的确切作用机制，这可能有助于推动miR-126在预测和治疗DN方面的治疗应用。
Ethics Statement
本研究经黑龙江中医药大学附属第一医院伦理委员会批准，所有参与者在入组前均签署知情同意书。
Conflicts of Interest
作者声明无利益冲突。
Author Contributions
构思与设计：Jie Yun, Yexu Song。方法学开发：Tianqi Liu, Yake Lan, Chaofan Dong。数据采集：Xin Bao, Liming Zhu, Shan Luo。文稿撰写、审阅和/或修订：Jie Yun, Liqun Song, Yexu Song。
Funding
本研究得到黑龙江省博士后资助项目（项目编号：LBH-Q21043）、黑龙江省自然科学基金（项目编号：PL2024H215）、黑龙江省省属本科高校优秀青年教师基础研究支持计划（项目编号：YQJH2023153）和黑龙江省中医药管理局项目（项目编号：ZHY2024-222）的支持。
Acknowledgments
作者特别感谢所有对本文提供帮助的人士。
Data Availability Statement
支持本研究结果的数据可在向通讯作者合理要求后获取。
