AMSC-sEVs通过递送MFGE8抑制巨噬细胞-肌成纤维细胞转化改善克罗恩病肠纤维化

《Cell Proliferation》：AMSC-sEVs Ameliorated Crohn's Disease by Inhibiting Macrophage-Myofibroblast Transition Through the Delivery of MFGE8

本文揭示了巨噬细胞-肌成纤维细胞转化（MMT）在克罗恩病（CD）肠纤维化中的关键作用。研究发现TGF-β1通过激活MAPK信号通路诱导巨噬细胞发生MMT，产生表达α-SMA的肌成纤维细胞并分泌CCL17，后者通过CCL17-CCR4轴招募调节性T细胞（Tregs）形成促纤维化微环境。脂肪来源间充质基质细胞的小细胞外囊泡（AMSC-sEVs）可递送MFGE8抑制MAPK通路，从而阻断MMT过程并改善肠纤维化，为CD治疗提供了新策略。

　　

1 引言

克罗恩病（Crohn's disease, CD）是一种慢性炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD），其病理过程常伴随肠道狭窄和梗阻等严重症状。尽管治疗手段有所改进，肠纤维化仍是CD患者肠道狭窄的主要原因，其核心机制涉及细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的异常沉积。

近年研究发现，巨噬细胞-肌成纤维细胞转化（macrophage-myofibroblast transition, MMT）在纤维化疾病中发挥关键作用。巨噬细胞（macrophage, M?）在炎症刺激下发生表型转化，获得肌成纤维细胞特性，诱导ECM过度产生和促纤维化因子分泌。然而，MMT在CD相关肠纤维化中的具体作用机制尚不清楚。

调节性T细胞（regulatory T cells, Tregs）作为具有免疫抑制功能的CD4⁺T细胞亚群，在肠道炎症修复中起重要作用。但持续炎症下，Tregs大量分泌的TGF-β可能激活TGF-β/Smad信号通路促进纤维化。研究表明，巨噬细胞可通过分泌趋化因子配体17（Chemokine Ligand 17, CCL17）招募表达趋化因子受体4（Chemokine Receptor 4, CCR4）的Tregs至损伤部位促进纤维化，但MMT是否通过CCL17/CCR4轴调控Tregs招募在CD纤维化中发挥作用仍有待探索。

细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）作为细胞分泌的纳米级囊泡，在疾病调控中展现出独特优势。特别是脂肪来源间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stromal cells, AMSCs）分泌的小细胞外囊泡（small extracellular vesicles, sEVs）富含多种生物活性分子，可通过旁分泌方式调节受体细胞功能。前期研究表明，AMSC-sEVs通过递送乳脂肪球表皮生长因子8（Milk Fat Globule EGF Factor 8, MFGE8）改善肠纤维化，但MFGE8是否通过抑制MMT缓解CD相关肠纤维化尚不明确。

2 材料与方法

本研究通过分析CD患者狭窄肠道组织和TNBS诱导的CD小鼠模型，探讨MMT在CD肠纤维化中的作用机制。从患者手术切除标本中获取狭窄肠道组织和相邻正常组织，进行组织化学分析和流式细胞术分析。通过差速超速离心法分离AMSC-sEVs，并通过透射电镜和纳米颗粒跟踪分析进行鉴定。

建立TNBS诱导的CD小鼠模型，分别给予巨噬细胞清除剂氯膦酸盐脂质体（clodronate liposomes, CL）、巨噬细胞过继转移、AMSC-sEVs和AMSC-sEVs-shMFGE8处理，评估结肠损伤程度、纤维化面积和细胞浸润情况。体外实验中，使用TGF-β1诱导巨噬细胞发生MMT，并利用MAPK抑制剂SB203580和CCL17中和抗体探讨相关机制。

3 结果

3.1 CD患者中存在MMT和Tregs浸润

CD患者狭窄肠道组织中出现肠黏膜腺体变形、扭曲和缺失，伴大量炎症细胞浸润。免疫组化显示狭窄组织中α-SMA表达显著增加。流式细胞术检测发现狭窄组织中F4/80⁺α-SMA⁺巨噬细胞比例显著升高，表明MMT增强。Western blot显示狭窄组织中COL1A1、FN1和VIM蛋白表达水平显著上调。有趣的是，流式细胞术结果显示CD患者狭窄肠道组织中CD4⁺细胞和CD4⁺FoxP3⁺细胞（Tregs）比例升高，表明CD患者存在巨噬细胞来源的肌成纤维细胞和Tregs浸润增加。

3.2 CD小鼠呈现MMT和Tregs浸润增加

TNBS诱导的CD小鼠出现体重减轻、疾病活动指数（disease activity index, DAI）评分升高、结肠重量增加、结肠长度缩短和结肠形态损伤指数（colonic mucosal damage index, CMDI）评分显著升高。组织学分析显示CD小鼠结肠黏膜完整性破坏，大量炎症细胞浸润黏膜层，部分肌层增厚。天狼星红和马松染色显示模型组胶原沉积显著增加。流式细胞术和免疫荧光证实模型组F4/80⁺α-SMA⁺巨噬细胞比例显著高于对照组，CD68荧光强度显著高于α-SMA，表明转化的细胞仍保留强巨噬细胞特性。同时，FoxP3⁺Tregs比例和表面CCR4表达在CD小鼠中显著增加。

3.3 巨噬细胞接种增强CD小鼠MMT和Tregs比例

体内成像显示外源性巨噬细胞定位于CD小鼠结肠组织。流式细胞术分析表明，模型组F4/80⁺α-SMA⁺巨噬细胞比例显著升高，CL处理显著降低该比例，而巨噬细胞接种导致CD小鼠中该比例显著增加。Western blot证实巨噬细胞接种逆转了CL处理介导的α-SMA和COL1A1蛋白水平抑制。免疫荧光双标显示CL + M?组α-SMA⁺CD68⁺双阳性细胞比例显著高于CL组，且CD68荧光强度高于α-SMA。Tregs亚群分析显示模型组和CL + M?组FoxP3⁺Tregs比例和表面CCR4表达显著上调，CL + M?组FoxP3⁺CCR4⁺双阳性细胞比例略高于模型组。

3.4 TGF-β1通过激活MAPK信号通路诱导MMT

Western blot检测显示CD小鼠中TGF-β1和p-p38 MAPK表达水平升高，CL处理下调其表达水平，而巨噬细胞处理显著逆转CL处理介导的抑制。细胞实验中，TGF-β1处理升高巨噬细胞中α-SMA和COL1A1表达水平，MAPK抑制剂SB203580抑制此效应。免疫荧光标记显示TGF-β1 + SB203580组显著降低TGF-β1诱导的α-SMA⁺细胞比例增加，表明TGF-β1通过激活MAPK信号通路诱导MMT。

3.5 TGF-β1诱导的MMT通过CCL17与CCR4相互作用招募Tregs

体内实验免疫荧光分析显示，与对照组和CL组相比，模型组CCL17和α-SMA荧光强度显著增加，巨噬细胞接种也引起显著增加。定量评估显示CL + M?组CCL17信号最强，α-SMA荧光趋势与CCL17一致。ELISA结果显示CL处理抑制CD小鼠CCL17水平，CL + M?处理恢复CCL17产生。在TGF-β1诱导的巨噬细胞中，CCL17 mRNA水平和上清CCL17含量在TGF-β1干预组显著高于NC组，SB203580添加抑制此效应。

巨噬细胞与Tregs共培养实验显示，添加CCL17中和抗体导致Treg细胞上清中CCL17显著降低。CCK-8和伤口愈合实验证明TGF-β1处理的巨噬细胞促进Tregs增殖和迁移，CCL17中和抗体逆转此效应。qRT-PCR和Western blot显示TGF-β1处理的巨噬细胞引起Tregs中CCR4上调，抗CCL17处理降低CCR4表达水平。Co-IP实验证实CCL17与CCR4存在相互作用，表明TGF-β1诱导的肌成纤维细胞转化通过CCL17与CCR4间相互作用招募Tregs。

3.6 AMSC-sEVs通过递送MFGE8抑制MMT

透射电镜和纳米颗粒跟踪分析显示AMSC-sEVs呈碟形膜结构，直径50-150纳米。Western blot证实sEV标志物CD63在AMSC-sEVs中丰富表达。MFGE8敲低效率验证显示shMFGE8-1在三种序列中敲低效率最高。DIO染料标记显示AMSC-sEVs可成功进入巨噬细胞。

Western blot分析显示AMSC-sEVs显著抑制TGF-β1诱导的α-SMA、COL1A1和p-p38 MAPK表达，MFGE8敲低部分逆转此效应。免疫荧光分析进一步揭示AMSC-sEVs组α-SMA⁺细胞比例降低，shMFGE8处理导致巨噬细胞中α-SMA⁺细胞比例增加。ELISA和qRT-PCR显示AMSC-sEVs显著降低上清CCL17含量和CCL17 mRNA水平，MFGE8敲低减弱此效应，表明AMSC-sEVs通过递送MFGE8抑制MMT。

3.7 AMSC-sEVs递送MFGE8抑制CD小鼠MMT和肠纤维化

体内实验显示，AMSC-sEVs显著改善CD小鼠体重、DAI评分、结肠重量、结肠长度和CMDI评分，而AMSC-sEVs-shMFGE8对CD小鼠产生相反影响。组织学分析显示AMSC-sEVs组肠道黏膜完整性破坏减轻，炎症细胞浸润减少。马松染色和天狼星红染色结果显示AMSC-sEVs减轻CD小鼠结肠组织纤维化，AMSC-sEVs-shMFGE8促进纤维化。

Western blot证实AMSC-sEVs显著抑制α-SMA、COL1A1和p-p38 MAPK表达水平，MFGE8敲低逆转此效应。流式细胞术分析显示AMSC-sEVs显著降低F4/80⁺α-SMA⁺巨噬细胞和FoxP3⁺Tregs比例，shMFGE8处理导致其增加。免疫荧光双标显示AMSC-sEVs处理显著减少CD68⁺α-SMA⁺双阳性细胞和α-SMA⁺CCL17⁺细胞，shMFGE8处理导致其显著上调，表明AMSC-sEVs通过递送MFGE8抑制MMT和CD小鼠肠纤维化。

4 讨论

本研究首次系统证实MMT在CD相关肠纤维化中的核心作用。研究发现CD患者狭窄肠道组织和TNBS诱导的CD小鼠模型中均存在MMT过程增强和Tregs浸润增加。机制上，TGF-β1通过激活MAPK信号通路诱导巨噬细胞向肌成纤维细胞转化，转化后的细胞分泌CCL17，通过CCL17-CCR4轴招募Tregs至肠道损伤部位。

值得注意的是，Tregs在炎症持续过程中分泌的大量TGF-β可能激活肠道成纤维细胞中的TGF-β/Smad信号通路，促进ECM分泌和纤维化形成，这可能是Tregs促进肠纤维化进展的潜在机制。研究首次揭示AMSC-sEVs可通过递送MFGE8抑制MAPK信号通路激活，阻断MMT过程并减少CCL17介导的Tregs招募，最终改善CD肠纤维化。

5 结论

本研究证明在CD相关肠道炎症条件下，TGF-β1激活MAPK信号通路，促进MMT和CCL17分泌。CCL17通过与Tregs表面CCR4受体结合，招募Tregs至肠道损伤部位促进纤维化。AMSC-sEVs通过递送MFGE8抑制MAPK信号通路，干预MMT过程，最终改善肠纤维化。这些发现不仅确立了MMT通过CCL17-CCR4轴驱动CD相关肠纤维化的关键机制，还凸显了AMSC-sEVs作为针对这一病理过程的有前景的无细胞治疗策略。