《Cell Death Discovery》：Salmonella typhimurium co-expressing cytolysin A and hyaluronidase suppresses tumor growth and metastasis
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本研究针对减毒细菌疗法在肿瘤治疗中后期易复发、免疫应答不足的难题，构建了可诱导共表达溶细胞素A(ClyA)和透明质酸酶(HysA)的工程化鼠伤寒沙门氏菌CNC018pCH。该菌株通过局部分泌ClyA诱导肿瘤细胞PANoptosis（焦亡、凋亡、坏死）并释放危险信号，同时利用HysA降解透明质酸(HA)破坏肿瘤微环境，在多种小鼠肿瘤模型中显著抑制肿瘤生长和转移，并诱导长期免疫记忆，为细菌介导的癌症治疗提供了新策略。
在癌症治疗领域，传统疗法如化疗和放疗虽然取得了一定成效，但往往伴随着严重的副作用和易产生耐药性等问题。近年来，细菌介导的癌症治疗(Bacteria-mediated cancer therapy, BCT)作为一种新兴策略受到广泛关注。某些细菌，如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，具有天然靶向肿瘤组织的特性，能够在肿瘤缺氧区域富集，从而特异性地杀伤肿瘤细胞。然而，减毒沙门氏菌虽然在早期能够抑制肿瘤生长，但在治疗后期常常出现肿瘤复发的情况，表明其诱导的免疫反应不足以实现完全的抗肿瘤效果。
为了解决这一难题，来自全南大学医学院分子影像与治疗学研究所的研究团队开展了一项创新性研究，他们成功构建了一种工程化的沙门氏菌，能够同时表达两种抗肿瘤效应分子，显著增强了治疗效果。这项研究成果发表在《Cell Death Discovery》杂志上，为细菌介导的癌症治疗提供了新的思路和方法。
研究人员使用的主要技术方法包括：基因工程技术构建含有强力霉素(Doxy)诱导型表达系统的质粒；蛋白质印迹法(Western blot)检测蛋白表达；流式细胞术分析细胞死亡方式；酶联免疫吸附试验(ELISA)检测透明质酸水平；体外侵袭实验评估细胞转移能力；小鼠肿瘤模型（包括CT26结肠癌和4T1乳腺癌模型）评估体内治疗效果；免疫荧光显微镜观察细菌在肿瘤组织中的分布；流式细胞术分析肿瘤免疫微环境变化。
工程化沙门氏菌(CNC018pCH)共表达ClyA和HysA
研究团队首先构建了含有强力霉素诱导型双启动子(PtetA/PtetR)的质粒pCH，该质粒同时携带溶细胞素A(cytolysin A, ClyA)和透明质酸酶(hyaluronidase, HysA)基因。将这一质粒转入减毒沙门氏菌株CNC018(缺失ppGpp合成基因relA和spoT，以及沙门氏菌致病岛SPI-1和SPI-2)中，获得工程菌株CNC018pCH。实验证实，在强力霉素诱导下，该菌株能够有效表达并分泌这两种蛋白，且对细菌生长影响极小。
ClyA通过PANoptosis途径杀死癌细胞
研究显示，CNC018pCH分泌的ClyA能够在肿瘤细胞膜上形成孔隙，诱导一种名为PANoptosis的细胞死亡方式，包括焦亡(pyroptosis)、凋亡(apoptosis)和坏死(necrosis)。这种综合性的细胞死亡方式导致肿瘤细胞迅速破裂，释放出ATP、HMGB1等危险信号分子，激活免疫系统。值得注意的是，ClyA的杀伤效果与肿瘤细胞膜上的胆固醇水平密切相关，胆固醇水平高的细胞对ClyA更为敏感。
HysA重塑肿瘤微环境抑制转移
另一方面，HysA通过降解肿瘤细胞外基质中的主要成分透明质酸(hyaluronic acid, HA)，破坏了肿瘤微环境的结构完整性。这不仅促进了细菌在肿瘤组织中的渗透和分布，还通过下调 ribosomal S6 kinase (RSK)相关信号通路，抑制了肿瘤细胞的侵袭和转移能力。实验证明，HysA处理能够显著降低高转移性肿瘤细胞的侵袭能力。
优化体内治疗的强力霉素剂量
研究人员在小鼠模型中优化了诱导蛋白表达所需的强力霉素剂量，发现17 mg/kg的剂量能够在肿瘤组织中实现最佳的目标蛋白表达，而对细菌的定植和存活没有显著影响。
CNC018pCH有效抑制小鼠肿瘤生长和转移
在CT26结肠癌和4T1乳腺癌小鼠模型中，CNC018pCH表现出显著优于单一表达ClyA或HysA菌株的抗肿瘤效果。它不仅能有效抑制原发肿瘤的生长，还能显著减少4T1肿瘤的肺转移。更重要的是，经CNC018pCH治疗后肿瘤完全消退的小鼠，在90天后再次接种肿瘤细胞时表现出完全的保护作用，表明该治疗能够诱导长期的抗肿瘤免疫记忆。
CNC018pCH治疗诱导的免疫应答特征
通过流式细胞术分析肿瘤组织和肿瘤引流淋巴结中的免疫细胞群体，研究发现CNC018pCH治疗能够显著增加肿瘤中细胞毒性T细胞的浸润，并促进树突状细胞的活化，从而将肿瘤免疫微环境从免疫抑制状态重塑为免疫激活状态。
这项研究成功地开发了一种新型的工程化沙门氏菌，能够同时在肿瘤局部递送两种具有协同作用的治疗分子。ClyA通过诱导免疫原性细胞死亡激活抗肿瘤免疫应答，而HysA则通过降解肿瘤基质增强细菌渗透并抑制转移过程。这种双管齐下的策略有效地解决了传统细菌疗法在肿瘤治疗中后期效果不足的问题。
研究还揭示了ClyA诱导的PANoptosis细胞死亡机制以及HysA通过调控RSK信号通路抑制转移的新机制，为理解细菌介导的癌症治疗的作用原理提供了新的视角。尽管该研究在胆固醇依赖性杀伤效应和HA-CD44-RSK信号通路的具体机制方面仍有待进一步阐明，但工程菌CNC018pCH展现出的良好抗肿瘤效果和安全性，为其未来的临床转化奠定了坚实基础。
这项研究不仅为细菌介导的癌症治疗提供了新的技术方案，也展示了工程化微生物在肿瘤治疗中的巨大潜力。随着对肿瘤微环境认知的深入和基因工程技术的进步，类似CNC018pCH这样的"活体药物"有望在未来癌症治疗领域发挥越来越重要的作用。
