《Ecology and Evolution》：Different Flowering Strategies Ensure Reproductive Success in Two Coexisting Self-Incompatible Orchids
引言
传粉限制是兰科植物繁殖生态学中的一个基本制约因素，对该多样化植物家族的进化施加了显著的选择压力。兰科植物通过非凡的进化创新来应对这一约束，包括极高的物种多样化、特化的花部性状和复杂的传粉策略。作为主要依赖异交、且完全依靠动物传粉者进行有性繁殖的物种，兰花通常表现出特化的传粉系统。因此，兰花的结实率通常较低，在非自花授粉物种中常低于10%，其中传粉限制和自交不亲和性被认为是主要的制约因素，而非资源限制。此外，即使在有回报且自交不亲和的物种中，由于同株异花授粉导致的显著花粉损失也可能造成低结实率，尽管其花粉块移除和沉积率可能很高。
开花植物在繁殖物候上表现出巨大的变异，其中两种主要策略沿连续体出现：集中开花（mass-flowering，特征是在短期内同步产生大量花朵）和稳态开花（steady-state flowering，特征是在较长时间内异步产生少量花朵）。这些 contrasting 策略从根本上影响了植物-传粉者的相互作用和繁殖结果，其中稳态开花通常与较高的异交率相关。在有回报的物种中，花蜜是主要的传粉者吸引物，能增加访花频率，并通常导致比欺骗性物种更高的结实率。然而，这两种策略都面临传粉限制的挑战，集中开花可能增加同株异花授粉及随后的花粉折扣（pollen discounting）。这在自交亲和的物种中创造了一种进化权衡，即介于传粉者吸引和交配质量之间。
被子植物进化出许多机制来优化授粉效率同时减少自花授粉，其中自交不亲和性（self-incompatibility）是防止近交最有效的遗传屏障。该系统维持了植物种群中的遗传多样性。许多兰花物种是自交亲和的，并采用各种授粉前机制来防止自花授粉。在其他自交不亲和的物种中，同株异花授粉仍然是一个重要的繁殖限制，导致胚珠和花粉折扣，并常常导致花器官败育。各种防止同株异花授粉的机制已被记录，包括顺序开花、雌雄蕊异熟/雄蕊先熟、花粉块运动以及特化的传粉结构。
在对云南西南部古茶园兰花多样性的调查中，我们发现了两种共存的物种——节茎石仙桃（Pholidota articulata）和黄绿贝母兰（Coelogyne prolifera），它们经常生长在同一棵遮荫树上，并在老班章古茶园（LBZ）表现出部分重叠的花期。这些生态优势物种（分别有284和313个开花个体）是研究自交不亲和兰花繁殖策略的理想模型。鉴于自交不亲和兰花通常面临的极端繁殖限制（结实率常<2%），本研究旨在：（1）表征这两种物种在开花模式和花部性状上的差异；（2）识别传粉者组合和访花模式；（3）阐明这些生态重要但研究不足的物种在维持繁殖成功的同时减少同株异花授粉的机制。
材料与方法
研究物种与地点描述
附生兰花P. articulata和C. prolifera（兰科）广泛分布于热带和亚热带亚洲。它们代表了两个物种丰富的属（Pholidota约30种；Coelogyne约200种），在中国表现出不同的生物地理格局（分别有12和31种），在西双版纳记录有5种和12种。两种物种均显示总状花序和同步的五月开花，但形态不同：P. articulata在假鳞茎顶端产生绿白色花，而C. prolifera在假鳞茎与叶的连接处开出黄绿色花。值得注意的是，五月是该地区雨季的开始。
野外工作在西双版纳傣族自治州勐海县布朗山乡老班章古茶园（LBZ）进行。该亚热带山地生态系统年均温18.7°C，年降水量1342–1540 mm。研究物种在古茶树和遮荫树上表现出共存的分布，其中P. articulata的海拔分布范围（800–2500 m）比C. prolifera（1200–2000 m）更广。数据收集涵盖了2019年至2022年的开花和结果季节。
物候与花部性状分析
为了比较P. articulata和C. prolifera的开花物候性状，我们在2021年开花季节随机选择并观察了每种至少70株开花个体。记录开花花序的数量、每个花序上的花朵数、开放花朵的顺序以及开花时间以供进一步分析。通过标记每种处理下五个个体的20朵花，比较了去雄（移除花粉块）、授粉和完整花朵的花寿命。我们根据花朵在传粉过程中是否具有吸引传粉者的作用来判断其“开放”或“凋谢”。记录了每个标记植株每日开花比例以及开放和凋谢时间，以确定两个物种花期的重叠程度。
我们在2022年开花期研究了花部形态。我们移除了两种物种新开放花朵的整个花粉块，并在0-5分钟内观察花梗或蕊喙是否表现出任何运动。随后，我们监测了授粉后几小时内柱头腔的变化。随机选择每个物种10个不同个体的20朵新开花，使用电子游标卡尺测量花大小。此外，我们随机选择开花前套袋的20个个体的20个花序，测量花蜜体积和蔗糖浓度。为了测量每朵花的花蜜体积，我们在12:00至14:00之间随机选择10个个体的40朵新开花，使用10-μl Sigma“microcap”校准毛细管。为了测量花蜜中的总糖浓度，我们准备了10个样品，每个样品包含来自一个个体的10朵花的混合物（单花花蜜量达不到测量标准）。我们同时使用手持式温度补偿折射计（Eclipse）对每个物种进行测量。
传粉者观察
对每种物种的传粉者观察在LBZ古茶园连续三个开花季节（2019–2021年）进行。每天主要在当地时间8:00至19:00对两种物种进行观察。每次观察随机选择一个个体的10个花序。仔细观察访问两种兰花的个体传粉者，以确定其传粉行为，包括记录平均每小时访问次数和每个花序访问的花朵数。此外，我们比较了晴天和雨天传粉者对两种兰花访问频率的差异，每种条件进行了20小时的观察。在观察期间拍摄了所有访花者物种的照片。为了识别物种并观察花粉块在其身体不同部位的沉积，我们尝试在观察期结束时捕获每种传粉者5-10个个体。本研究所检查的兰花物种和传粉者的凭证标本保存在云南大学生态与环境学院植物标本馆和收藏中。
人工授粉实验
为了研究P. articulata和C. prolifera的繁育系统，在2022年开花季节原位进行了三种人工授粉处理：（1）套袋：将P. articulata的150朵花（来自20个花序）和C. prolifera的50朵花（来自20个花序）用网袋套住以排除传粉者。（2）自花授粉：开花前，将P. articulata的95朵花（来自20个花序）和C. prolifera的100朵花（来自30个花序）套袋，随后使用来自同一朵花或同一植株上另一朵花的花粉进行人工授粉。（3）异花授粉：开花前，将P. articulata的305朵花（来自15个花序）和C. prolifera的48朵花（来自10个花序）套袋，并手动使用来自至少50米外的同种个体花粉进行授粉。在开花期结束后评估每种处理的结实率。
为了测试在自然杂交种不存在的情况下潜在的种间生殖障碍，我们按照标准方法在P. articulata和C. prolifera之间进行了相互杂交授粉。总共使用了100朵花（每个方向50朵），来自30个花序，并在2022年繁殖季节结束时评估结实率。
花粉块移除、沉积与结实率
为了估计雄性和雌性繁殖成功率，我们在2021年开花前标记了P. articulata的31个花序和C. prolifera的36个花序（来自总共30个个体）。我们从花朵第一天开始，每天监测并记录花粉块的移除和沉积。开花期（整个开花期）结束后，通过计算具有花粉块移除、沉积和产生果实的的花朵数占检查花朵总数的比例，来计算整个开花期间的花粉块移除率、沉积率和结实率。
两种物种的自然结实率连续调查了三年（从2019年到2021年），标记了更多数量的个体。所使用的花朵、花序和个体数量总结在表中。
数据分析
所有物候性状、花部性状、不同传粉者访问每个花序的花朵数以及三年平均自然结实率的差异均使用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行分析。采用广义线性模型（General Linear Model, GLM）分析不同年份和不同兰花物种之间传粉者访问率（次/小时）的变异。人工异花授粉的花粉块移除率、沉积率、结实率以及自然结实率使用Mann–Whitney检验进行比较。所有统计分析均使用R（版本4.4.2）进行。
结果
物候与花部性状
两种兰花在5月至7月期间表现出开花活动，这与我们西双版纳研究地点雨季（5月至10月）的开始时间相吻合。我们2021年的观察显示它们的开花物候部分重叠，P. articulata花期从5月12日到6月9日（持续28天），而C. prolifera从5月15日到7月13日（持续60天）。花寿命在物种间差异显著：在P. articulata中，完整花朵持续4.65±0.73天（平均值±标准差；n=20），显著长于去雄花朵（2.55±0.59天；p<0.001）或授粉花朵（2.40±0.49天；p<0.001）。对于C. prolifera，完整花朵持续13.05±1.36天，与去雄花朵（12.40±0.48天；p=0.12）无显著差异，但显著长于授粉花朵（7.50±0.81天；p<0.001）。值得注意的是，C. prolifera的花朵表现出显著长于P. articulata的花寿命（p<0.001）。
两种物种都表现出顺序开花的模式，但在花序结构上不同。P. articulata产生紧密排列的花序（21.07±9.70个花序/植株；n=30），花朵向心式开放（18.75±6.29朵花/花序；n=36），在第5天达到开花高峰。相反，C. prolifera形成松散的花序（6.30±3.18个花序/植株；n=30），花朵离心式开放（4.61±0.68朵花/花序；n=36），在第12天达到最大花展示。P. articulata的花展示（花朵和花序数量）显著超过C. prolifera（所有p<0.001）。
花部形态在物种间表现出趋同，每朵花都有四个完整且不可分割的花粉块，每个都有一个明确的黏盘，并且没有距。两个物种在花粉块移除后5分钟内均未表现出花梗或蕊喙的运动。授粉后，蕊喙在3-4小时内覆盖柱头腔，防止额外的花粉沉积。虽然花的尺寸在物种间统计上相似（长度：p=0.06；宽度：p=0.08），但花蜜回报差异很大。两个物种都将花蜜直接分泌到唇瓣上，但P. articulata产生的花蜜量显著更多，糖浓度也高于C. prolifera（所有p<0.001）。
传粉者观察
从2019年到2021年，对P. articulata的传粉者观察总时长为200小时，对C. prolifera为210小时。我们记录了五种昆虫访问P. articulata，四种访问C. prolifera，但只有两种胡蜂物种——Vespa velutina（凹吻胡蜂）和Vespa mandarinia（金环胡蜂）——通过直接观察花粉块附着被确认为共享的主要传粉者。两种兰花的花粉块 consistently 沉积在这些胡蜂头部的相似区域。Bombus breviceps（短头熊蜂）尽管对C. prolifera花朵显示出最高的访问频率（2019年：7.23±2.80；2020年：7.93±3.29；2021年：7.43±3.23次/小时；n=每年20小时），但在三年研究期间未在其身体上发现花粉块，因此被确定为盗蜜者。
两种共享的传粉者物种对两种兰花表现出稳定的访问模式。在访问高峰期（每年每物种30观察小时），V. velutina在2019-2021年分别访问P. articulata 214、202和232次，而访问C. prolifera分别为103、89和116次。类似地，V. mandarinia访问P. articulata 193、218和199次，而访问C. prolifera分别为91、118和87次。虽然两种胡蜂对任一种兰花的访问频率均未显示出显著的年间变异（P. articulata: PV. velutina=0.3726, PV. mandarinia=0.3423; C. prolifera: PV. velutina=0.1109, PV. mandarinia=0.1193），但两种胡蜂在所有年份访问P. articulata的频率都显著高于C. prolifera（所有p<0.0001）。此外，两种物种的传粉者访问频率在雨天（P. articulata, 2.65±1.27; C. prolifera, 2.10±1.48; n=20）均显著低于晴天（P. articulata, 10.60±3.07; C. prolifera, 7.95±1.88; n=20; p<0.0001）。
在花序水平上，两种胡蜂物种在每个兰花物种内显示出相似的访问模式。对于P. articulata，V. velutina每个花序访问4.23±1.20朵花（n=22），而V. mandarinia为4.58±1.75朵（n=24；p=0.4405, t=0.7783）。在C. prolifera中，每个花序访问次数为2.73±1.05（V. velutina, n=22）和2.43±0.88（V. mandarinia, n=23；p=0.3266, t=0.9922）。然而，两种胡蜂物种在P. articulata上每个花序访问的花朵数均显著多于在C. prolifera上（V. velutina: p<0.0001, t=4.300; V. mandarinia: p<0.0001, t=5.164）。
人工授粉实验
两种兰花物种都表现出完全的自交不亲和性，所有套袋（完整花朵）和人工自花授粉的花朵都未能产生果实。人工异花授粉处理显示物种间结实率相似（P. articulata: 87.83%±6.94%, n=15个花序；C. prolifera: 90.17%±10.07%, n=10个花序；p=0.5157），证明了强烈的异交依赖性。两个方向的种间杂交（P. articulata ♀×C. prolifera ♂及其反交）均未产生果实，证实了这些共存物种之间存在有效的合子前生殖障碍。
花粉块移除、沉积与结实率
授粉成功模式在两种兰花物种间差异显著。在P. articulata中，首日花与整个开花期的花粉块移除率和沉积率无显著差异（移除：p=0.26；沉积：p=0.54）。然而，尽管开花期末的花朵实现了高花粉块沉积率（84.38%±7.02%, n=31），但只有31.08%±12.44%（n=31）发育成果实（p<0.0001），表明存在显著的花粉折扣（占沉积花粉块的63.17%）。C. prolifera的首日花花粉块移除率和沉积率显著低于整个开花期（所有p<0.0001）。与P. articulata类似，C. prolifera在整个开花期的花粉块沉积率（50.19%±21.98%, n=36）显著高于其结实率（27.92%±21.21%, n=36, p<0.0001）。然而，C. prolifera表现出比P. articulata更低的花粉折扣（44.37%）。
比较分析显示，P. articulata在所有花阶段的花粉块移除和沉积均显著高于C. prolifera（所有p<0.0001），但物种间的最终结实率相当（p=0.48）。三年监测显示P. articulata的结实率稳定（年间p>0.05），而C. prolifera表现出显著的年度变异，2019年的结实率高于2020年（p<0.05）。尽管存在这些时间差异，但三年平均结实率在物种间无显著差异（p=0.09）。
讨论
我们在LBZ古茶园的野外观察记录到两种共存、同期开花的自交不亲和兰花物种（P. articulata和C. prolifera）。虽然历史上认为自交不亲和性在兰科中相对罕见，但最近的研究揭示，自交不亲和性实际上在几个主要的兰花谱系中普遍存在，包括Maxillariinae、Pleurothallidinae和Oncidiinae。除了普遍性之外，对Dendrobium（石斛属）、Pleurothallis（肋茎兰属）和Anathallis（拟安兰属）等多个属的研究进一步揭示了自交不亲和性与花部性状之间复杂的进化相互作用。本研究首次对Pholidota（石仙桃属）物种的传粉生物学进行了全面研究，同时扩展了我们对Coelogyne（贝母兰属）传粉系统的理解，并补充了先前关于胡蜂和蜜蜂传粉者的报道。值得注意的是，尽管在雨季普遍存在传粉限制，但两种物种都实现了远高于典型自交不亲和兰花（通常~2%）的结实率（21%–31%），表明它们通过独特的开花策略进化出适应以克服繁殖限制。
两种物种的花蜜特征反映了不同的资源分配策略。P. articulata产生的花蜜体积显著更大（约多66%），糖浓度也高于C. prolifera，尽管花蜜生产伴随着巨大的能量消耗。这种差异与它们 contrasting 的物候相一致：P. articulata为期28天的密集型开花期，具有大的花展示，而C. prolifera则为期60天的延长开花期，花朵较少但寿命更长（13.05±1.36天 vs. 4.65±0.73天）。这种时间生态位分化可能减少共享传粉者的种间竞争，同时随着时间的推移维持稳定的植物-传粉者相互作用。V. velutina和V. mandarinia在三年间稳定的访问模式表明这些胡蜂与两种兰花形成了可靠的互利共生关系，尽管对P. articulata的访问频率显著更高，这可能是由于其更慷慨的花蜜回报和显眼的花展示。
两个物种均缺乏花梗弯曲运动，这与达尔文提出的防止同株异花授粉机制形成对比，表明进化出了替代策略。P. articulata通过同步的集中开花实现授粉效率，其83.29%±6.52%的花朵在首日即完成授粉，尽管花展示很大，但有效地最小化了同株异花授粉的风险。这种策略利用了传粉者吸引，同时将繁殖事件集中在狭窄的时间窗口内。相反，C. prolifera的稳态开花通过花资源在空间和时间上的分散来减少同株异花授粉，尽管其传粉者访问率较低（首日授粉率仅4.54%±8.60%），但需要延长的花寿命。有趣的是，尽管B. breviceps作为盗蜜者发挥作用，但其对C. prolifera的频繁访问可能通过导致传粉者遇到更多空花而间接减少同株异花授粉，这随后减少了每株植物的访花次数，从而减少了无效的株内花粉转移。
繁殖成功模式揭示了物种间传粉限制的根本差异。虽然两者都显示出显著的花粉折扣（P. articulata: 63.17%；C. prolifera: 44.37%），但只有C. prolifera表现出明显的传粉限制（花粉块沉积率与结实率相比，p<0.0001）。这种对比凸显了在评估传粉限制时，同时评估雄性（花粉块移除）和雌性（结实率）繁殖成功率的重要性。共享
