基于受限氧化策略的多功能可注射壳聚糖-纳米黏土复合水凝胶用于增强骨移植修复

《Materials Today Bio》：Multifunctional injectable chitosan-based adhesive enhanced by limited oxidation for assisting bone grafting

本研究针对临界骨缺损治疗中植入物易松动、形状不匹配及感染炎症等问题，开发了一种基于受限氧化策略的可注射多功能纳米复合水凝胶（OCCL）。通过层状纳米黏土（LAP）调控邻苯二酚-壳聚糖（CC）的氧化交联，该水凝胶展现出高粘附强度（49.76 kPa）、水下粘附、抗氧化（ROS清除率>77%）、抗菌（对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌杀灭率>99.5%）及可降解特性。体外实验证实其能有效促进细胞增殖、成骨分化和血管生成，大鼠颅骨缺损模型显示OCCL水凝胶显著促进新骨形成。该研究为骨再生材料设计提供了创新思路。

　　

当遭遇严重骨缺损时，医生常需要植入骨材料来帮助修复。然而，传统的骨植入物存在几个棘手的问题：它们往往无法完美贴合不规则形状的骨缺损区域，容易松动移位；植入后可能引发感染和炎症反应；而且缺乏促进血管生长和新骨形成的能力。现有的骨水泥等临床粘合剂功能单一，难以满足复杂修复过程的多重要求。自然界中，贻贝通过足丝分泌的黏蛋白能在潮湿环境下牢固附着在岩石上，这得益于其含有的邻苯二酚基团。受此启发，科学家开始探索基于邻苯二酚化学的多功能生物材料。

在《Materials Today Bio》期刊上发表的一项研究中，华南理工大学的研究团队提出了一种创新策略：他们通过引入层状纳米硅酸盐黏土（Laponite, LAP）来精细调控邻苯二酚-壳聚糖（Catechol-Chitosan, CC）的氧化过程，开发出名为OCCL的可注射多功能纳米复合水凝胶。这种材料不仅像高级粘合剂一样能牢固粘合骨骼和植入物，还具备抗氧化、抗菌、促进血管生长和骨再生等多种功能，为骨缺损治疗提供了新的解决方案。

研究人员采用了几项关键技术方法：通过化学接合合成不同邻苯二酚取代度（DS_CA）的CC聚合物；利用纳米黏土（LAP）的限域效应调控高碘酸钠（NaIO₄）对CC的氧化程度；通过扫描电镜（SEM）、紫外光谱（UV-vis）和傅里叶变换红外光谱（FT-IR）表征材料结构；采用大鼠颅骨缺损模型（n=3）进行体内评价；通过RNA测序分析成骨相关信号通路。实验使用大鼠骨髓间充质干细胞（r-BMSCs）和MC3T3-E1成骨前体细胞进行体外功能验证。

3.1. OCCL水凝胶的设计与表征

研究显示，LAP的添加创造了碱性微环境，促进CC中邻苯二酚（CA）基团转化为邻苯醌，同时其层状结构有效限制了过度氧化聚合。当LAP浓度达到5 mg/mL（OCC₂L₅）时，水凝胶形成适度的多孔结构（图1b），FT-IR证实存在席夫碱（C=N）和氢键作用（图1f）。zeta电位测试表明带正电的CC与带负电的LAP之间存在静电相互作用（图1g）。这种可控氧化策略保留了CA基团的活性，为材料的多功能特性奠定了基础。

3.2. 粘附性能、降解和抗氧化活性

粘附测试表明，OCC₂L₅水凝胶对牛皮质骨的粘附强度达到49.76 kPa，显著高于无LAP组（18.25 kPa）（图2a）。该水凝胶在潮湿环境下仍能保持牢固粘附，可粘接多种材料（塑料、金属等）甚至湿润的猪皮（图2b-d）。在含溶菌酶的PBS中降解28天后，OCC₂L₅降解率达31.4%（图2e）。抗氧化实验显示其活性氧（ROS）清除率超过77%，羟基自由基（·OH）清除能力随LAP含量增加而增强（图2f,g）。

3.3. 抗菌活性

OCC₂L₅水凝胶对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌）和革兰氏阴性菌（大肠杆菌）均表现出强抗菌效果，菌落存活率仅0.3%-0.5%（图3a,b）。扫描电镜观察显示细菌出现膜皱缩和破裂（图3c,d），BCA蛋白检测和丙二醛（MDA）含量测定证实水凝胶通过破坏细菌膜结构导致内容物泄漏而发挥杀菌作用（图3e-g）。

3.4. 体外抗氧化和成骨能力

细胞实验显示OCC₂L₅能显著促进r-BMSCs增殖（图4a），JC-1染色表明其可维持线粒体膜电位，减轻氧化应激损伤（图4b,c）。成骨诱导7天后，碱性磷酸酶（ALP）染色显示OCC₂L₅组活性更强；14天后茜素红（ARS）染色显示更多钙结节形成（图4d）。qRT-PCR和Western blot检测证实该水凝胶显著上调ALP、BMP-2、COL-1、OCN、OSX和RUNX2等成骨相关基因和蛋白表达（图4e-h）。

3.5. 体外血管生成能力

人脐静脉内皮细胞（HUVECs）成管实验表明，OCC₂L₅处理组形成更完整的血管样结构（图5a-d）。基因表达分析显示其显著促进血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子-β（TGF-β）、缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、CD31和血管生成素1（ANG1）的表达（图5e-g）。

3.6. 促成骨和血管生成的潜在机制

RNA测序分析发现，OCC₂L₅处理显著上调BMP6、RUNX1、HIF-1α、VEGF等基因（图6a-d）。基因集富集分析（GSEA）表明该水凝胶通过激活MAPK和Wnt信号通路促进成骨，通过HIF-1α和VEGF通路促进血管生成（图6e）。基因本体（GO）分析显示差异基因富集于细胞外基质、生长因子结合、血管生成和骨化等过程（图6f,g）。

3.7. 体内骨再生能力

大鼠颅骨缺损模型显示，植入12周后，OCC₂L₅组缺损区域几乎完全被新骨覆盖，微CT定量分析显示骨体积分数（BV/TV）显著高于对照组（图7a-c）。组织学染色（H&E、Masson、SO-FG）进一步证实OCC₂L₅组有大量成熟新骨形成（图7d）。主要器官组织学检查未发现明显毒性反应，表明材料具有良好的生物安全性。

该研究通过巧妙的"受限氧化"策略，成功构建了集可注射性、强粘附、抗氧化、抗菌、促血管生成和成骨等多功能于一体的OCCL水凝胶。与传统骨粘合剂相比，该材料在保持适度粘附强度（49.76 kPa）的同时，实现了功能的全面优化。特别是其通过调控氧化程度保留CA基团活性，结合LAP释放的生物活性离子（Mg²⁺、Li⁺、Si⁴⁺），协同激活MAPK和Wnt等关键信号通路，为骨再生创造了有利的微环境。这种材料设计策略不仅解决了骨植入物固定不稳的临床难题，还为功能性生物材料开发提供了新思路，在颅颌面骨缺损修复、牙科骨移植辅助等领域具有广阔应用前景。