《FEBS Open Bio》：FGFR Like1 drives esophageal cancer progression via EMT, PI3K/Akt, and notch signalling: insights from clinical data and next-generation sequencing analysis
Abstract
FGFRL1是FGFR家族中研究较少的成员，近期研究表明其与癌症相关，但在食管癌（EC）中的功能意义尚不明确。本研究通过免疫组化评估了106例EC患者组织中FGFRL1的表达，发现其在癌前和肿瘤组织中显著升高（P < 0.001，OR = 73.2；AUC = 0.817）。RNAi耦合的新一代测序分析显示EMT、PI3K/Akt和Notch通路富集。定量RT-PCR验证了顶级聚类基因和Notch通路基因的下调（P < 0.05）。Western blot结果显示磷酸化GSK3β、磷酸化Akt及间质标志物减少。TCGA数据支持其与EMT呈正相关。功能实验证实了FGFRL1的致癌作用，表现为G1期阻滞，以及增殖、迁移和侵袭能力降低（P < 0.001）。本研究突显了FGFRL1作为EC进展的关键驱动因子。
Abbreviations
本研究涉及的主要缩写包括：DEGs（差异表达基因）、EAC（食管腺癌）、EC（食管癌）、EMT（上皮-间质转化）、ESCC（食管鳞状细胞癌）、FBS（胎牛血清）、FGFR（成纤维细胞生长因子受体）、IHC（免疫组化）、NGS（新一代测序）、OC（卵巢癌）、OSCC（口腔鳞状细胞癌）、SD（标准差）。
引言
食管癌（EC）在全球癌症发病率中排名第十一位，死亡率高，尤其是在中国和印度。尽管化疗、放疗和手术切除等治疗手段有所进展，但EC的五年生存率仍低于20%，这主要归因于诊断延迟、缺乏有效生物标志物以及化疗耐药性的产生。虽然靶向治疗策略在多种癌症中显示出改善患者预后的潜力，但EC有效治疗靶点的有限性继续阻碍这一致命疾病的充分管理。因此，亟需研究驱动食管癌恶性进展的关键分子机制，以期识别新的治疗靶点。
成纤维细胞生长因子受体（FGFR）信号通路是参与致癌作用的关键通路之一。它通过获得体细胞分子改变直接刺激癌细胞增殖、存活和抗癌药物耐药性，从而促进癌症进展。在EC中，经典的FGFR受体（FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4）经常通过基因扩增、突变、选择性剪接和配体介导的激活等机制发生改变。这些受体属于高度保守的跨膜酪氨酸激酶受体（RTK）家族，通过Ras/Raf–MEK-MAPKs、PI3K/AKT、PLCγ和STAT等下游通路调节关键的细胞过程，包括增殖、迁移、分化和存活。
最近，FGFR家族的一个新成员，成纤维细胞生长因子受体样1（FGFRL1），已成为癌症中一个潜在的靶点。FGFRL1是一种由504个氨基酸组成的跨膜蛋白，与经典FGFRs具有结构相似性，包括三个免疫球蛋白样（Ig-like）胞外结构域和一个单跨膜螺旋。然而，FGFRL1与其他FGFR家族成员的不同之处在于其C端胞质区缺乏负责FGFR信号转导的经典酪氨酸激酶结构域。尽管如此，最近的研究表明，FGFRL1可能仍然通过其C端结构域中的特定基序介导下游信号转导。例如，Zhuang等人（2010）在FGFRL1的C端区域发现了SH2结构域结合基序、PDZ结构域结合基序、ITAM和ITIM基序的存在，这些可能有助于细胞内信号转导。此外，Silva等人（2013）证明FGFRL1短胞质结构域中的一个SH2结合基序与酪氨酸磷酸酶SHP1相互作用，表明FGFRL1可以增强ERK1/2信号转导。
新兴证据强调了FGFRL1在多种癌症中的致癌潜力。例如，Chen等人（2020）显示FGFRL1在小细胞肺癌细胞中正向调节ENO1的表达并激活PI3K/Akt通路。此外，在卵巢癌细胞中FGFRL1敲低后Gli1和Gli2表达减少，提示FGFRL1在Hedgehog（Hh）信号通路中的潜在作用。而且，FGFRL1敲低后MAPK通路相关蛋白（如MEK和ERK）的磷酸化减少，进一步支持了其参与肿瘤进展。FGFRL1的表达失调在卵巢癌、肺癌、乳腺癌、直肠癌和前列腺癌等多种癌症中均有报道，凸显了其作为癌症生物学关键参与者的潜力。
在EC患者中，FGFRL1的表达及其功能作用和下游效应物仍然知之甚少。这一知识空白强调了对FGFRL1介导的信号在EC中进行彻底研究的必要性。本研究旨在深入探讨FGFRL1促进EC进展的分子机制。利用RNA干扰（RNAi）结合新一代测序（NGS）和过表达技术，我们试图揭示FGFRL1驱动ESCC细胞进展的复杂相互作用网络和通路。通过阐明FGFRL1在EMT、PI3K/Akt和Notch等关键信号通路中的作用，本研究旨在为FGFRL1介导的致癌机制提供关键见解，并评估其作为EC治疗靶点的潜力。
材料与方法
样本收集
从AIIMS消化内科接受内镜活检的患者共收集140例食管组织标本，包括106例肿瘤活检和34例匹配的远癌非恶性组织样本（取自肿瘤部位约5厘米外）。部分活检组织用10%福尔马林固定并石蜡包埋，用于苏木精-伊红（H&E）染色和免疫组化（IHC）分析。肿瘤队列（n = 106）根据组织病理学诊断分为食管鳞状细胞癌（ESCC, n = 41）、食管腺癌（EAC, n = 14）和癌前病变（n = 51）。分类基于训练有素的病理学家评估的标准组织病理学标准。使用结构化表格记录临床和病理数据，包括患者人口统计学特征（年龄、性别）、生活方式因素（烟草、酒精、茶消费和饮食）、家族史、肿瘤位置（食管上、中、下段）和组织学分化程度。根据机构伦理指南，获得了所有参与者的书面知情同意。
伦理批准
该研究获得了全印度医学科学研究所（新德里）机构研究伦理委员会（批准号：IEC-545/06.08.2021）以及Guru Gobind Singh Indraprastha大学（新德里Dwarka）机构研究伦理委员会（批准号：GGSIPU/IEC/2021-A1）的批准。所有涉及人类参与者的研究程序均符合全印度医学科学研究所伦理委员会和Guru Gobind Singh Indraprastha大学伦理委员会的伦理标准，并遵循1964年赫尔辛基宣言及其后的修正案或类似的伦理标准。
免疫组化
将EC和邻近非恶性组织的石蜡包埋块切成5微米厚的切片，裱贴在多聚赖氨酸包被的载玻片上。切片脱蜡、复水，并使用Tris-EDTA缓冲液进行抗原修复。通过将切片在0.3%过氧化氢甲醇溶液中孵育30分钟来淬灭内源性过氧化物酶活性。用1%正常马血清封闭以减少非特异性结合。然后将载玻片在4°C下与兔多克隆抗FGFRL1抗体（1:50稀释；Cloudclone）孵育过夜。第二天，冲洗载玻片，并在室温下与HRP标记的抗兔IgG聚合物检测试剂（ImmPRESS, Vector Laboratories）孵育30分钟。使用二氨基联苯胺（DAB）作为色原进行信号检测，细胞核用苏木精复染。使用H-score系统半定量评估免疫反应性，该系统考虑了染色强度和阳性染色细胞百分比。阳性百分比分级为：≤10% = 0, 11–20% = 1, 21–40% = 2, 41–60% = 3, 61–80% = 4, >81% = 5。染色强度评分为：微弱 = 1，中等 = 2，强 = 3。最终H-score通过强度和分布分数相加得出。为尽量减少观察者偏差，由两名独立评审员评估切片。若两名观察者之间存在差异，则进行联合审查以达成共识。基于受试者工作特征（ROC）曲线分析，设定总H-score 2为FGFRL1阳性的阈值：低于此截断值的评分视为阴性（0），高于此值视为阳性（1）。记录的信息包括患者人口统计学特征（年龄、性别）、生活习惯（饮食、茶、酒精和烟草使用）、家族史、肿瘤位置（食管上、中、下段）和组织学分化程度。
细胞培养与转染
人食管鳞癌细胞系KYSE-410在含10%热灭活胎牛血清（FBS）和1%抗生素的RPMI-1640培养基中，于37°C、5% CO2的湿润环境中培养。转染使用Lipofectamine 3000在无血清和无抗生素条件下进行。对于敲低实验，细胞用100 nM FGFRL1特异性siRNA或乱序对照siRNA转染。对于过表达研究，将全长人FGFRL1和C端缺失突变体（FGFRL1ΔC）克隆到mEGFP-N1载体的SalI/BamHI位点，经测序验证后转染到KYSE-410细胞中。
实时聚合酶链反应
使用RNAeasy mini kit从细胞系（转染了FGFRL1 siRNA或乱序siRNA或pCMV-FGFRL1-EGFP/pCMV-FGFRL1ΔC-EGFP或空载体）中提取总RNA。通过逆转录PCR从1微克总RNA合成cDNA。定量实时PCR在25微升反应体系中进行，包含0.5微米各基因特异性引物、12.5微升SYBR? Premix Ex Taq和2.5微升cDNA，使用CFX96实时PCR系统。PCR程序为：95°C 1分钟，然后进行40个循环的95°C 10秒变性、特定Tm下5秒退火和72°C 1分钟延伸。在每个延伸步骤结束时进行荧光检测。使用5s RNA作为内参标准化相对基因表达，并使用2?ΔΔCT方法计算。
Western blotting
KYSE-410细胞（转染了FGFRL1 siRNA或乱序siRNA或pCMV-FGFRL1-EGFP/pCMV-FGFRL1ΔC-EGFP或空载体）在RIPA缓冲液中裂解并刮取以分离总蛋白。裂解后，测量蛋白质浓度，通过SDS/PAGE分离蛋白质并转印至PVDF膜。膜用5%脱脂牛奶封闭，一抗4°C孵育过夜，然后与HRP标记的二抗孵育，使用增强化学发光试剂盒检测信号。使用ImageJ软件确定每个蛋白质的积分密度值（IDV）并用GAPDH密度值标准化。
mRNA富集与NGS转录组测序文库制备
FGFRL1敲低或乱序siRNA处理后分离500 ng总RNA。使用NEB Next磁性分离模块进行poly(A) mRNA富集，然后使用NEB RNA Library Prep Kit构建文库。使用TapeStation Analysis Software评估文库质量。cDNA经PCR扩增和纯化，最终DNA文库在15微升0.1× TE缓冲液中洗脱。
mRNA NGS数据分析-生物信息学与统计学
在Illumina HiSeq平台上进行双末端测序。使用FastQC和MultiQC软件检查数据质量。使用fastp处理原始序列读数以去除接头序列和低质量碱基。通过HISAT2将QC通过的高质量读数比对到GRCh38.p7人类参考基因组。使用Cuffdiff以FPKM量化转录本丰度。使用Spearman相关分析评估样本相关性。
通路与功能富集分析
使用Ingenuity Pathway Analysis软件分析差异表达基因（DEGs）的功能通路富集。通过Fisher精确检验进行通路识别和分子功能分析，并进行Benjamini–Hochberg多重检验校正。分析时，去除（a）log2折叠变化（log2FC）值在-2到2之间；（b）P > 0.05；（c）错误发现率（FDR）> 0.05；以及（d）所有样本FPKM<1的DEGs。进行无限制的通路分析。同时，使用Enricher和Funrich工具通过KEGG 2021 Human数据库、Human Molecular Signatures Database (MSigDB Hallmark) 2020和Mammalian Phenotype (MP) Ontology (MGI) mammalian phenotype 4, 2021进行深入分析。
WST-1实验
KYSE-410细胞用100 nM FGFRL1siRNA和乱序siRNA或pCMV-FGFRL1-EGFP/pCMV-FGFRL1ΔC-EGFP或空载体处理，在48小时进行WST-1增殖实验。加入细胞增殖试剂WST-1（10微升/孔），在37°C、5% CO2下孵育3小时。在摇床上充分震荡1分钟。使用酶标仪在450 nm和630 nm波长下测量样品吸光度相对于背景对照的值。将每个读数转换为增殖百分比。
集落形成实验
KYSE-410细胞转染FGFRL1 siRNA、乱序siRNA、pCMV-FGFRL1-EGFP、pCMV-FGFRL1ΔC-EGFP或空载体。转染48小时后，将细胞胰蛋白酶化并以3 × 103细胞/孔的密度接种在六孔板中。细胞培养6天，每2天更换培养基。用预冷甲醇固定集落，结晶紫染色并成像。使用ImageJ软件计数包含≥50个细胞的集落。
Boyden小室实验
KYSE-410细胞转染FGFRL1 siRNA或乱序siRNA。48小时后，通过胰蛋白酶消化收集细胞，重悬于1× PBS中，以8 × 104细胞/插入物的密度接种到Boyden小室中——包被或不包被Matrigel以分别评估迁移或侵袭能力。下室含有补充了10% FBS的RPMI作为趋化剂。在37°C孵育24小时后，从上膜表面移除未侵袭的细胞。固定、染色并可视化迁移或侵袭到下侧的细胞，使用倒置荧光显微镜进行定量。
3D液滴侵袭实验
细胞用血球计数器计数，将所需数量的细胞（50,000/液滴）加入1.5毫升Eppendorf管中的10% RPMI培养基中。离心后，轻轻吸除上清培养基。在冰上将Matrigel加入细胞沉淀中，每个液滴使用10微升Matrigel。将Matrigel-细胞液滴在37°C、5% CO2下孵育20分钟使其聚合。凝固后，向每孔加入2毫升补充了10% FBS的RPMI。每天对细胞成像，并使用ImageJ测量Matrigel液滴外部的迁移边缘。使用ImageJ的自由手工具画线测量整个Matrigel液滴和迁移细胞的面积。
细胞周期分析
对于细胞周期分析，用PBS洗涤细胞，用300微升胰蛋白酶解离，并在37°C孵育1分钟。用700微升完全培养基中和反应，离心收集细胞。去除PBS痕迹后，将细胞沉淀重悬于300微升PBS中制成单细胞悬液。然后加入700微升预冷的90%甲醇。分散细胞，并将试管在-20°C储存过夜。弃去固定液，用1毫升PBS洗涤细胞沉淀，离心。弃去上清，加入1毫升100微克/毫升RNase A工作溶液。重悬细胞沉淀并在37°C孵育30分钟。弃去上清，加入200微克/毫升碘化丙啶（PI）溶液，在黑暗中37°C孵育30分钟。去除多余的PI，通过离心和PBS洗涤，最终细胞悬液（500微升PBS）使用BD LSRFortessa? X-20进行流式细胞术分析。使用FlowJo v10.10_CL软件进行数据采集和分析。
统计学分析
所有实验数据使用GraphPad Prism软件进行分析。功能实验至少进行三次独立生物学重复，每个生物学重复包含相应的技术重复。数据表示为平均值±标准差（SD）。使用Student t检验评估两组间的统计学显著性，而多组比较在适当时使用单因素方差分析（ANOVA）进行评估。使用Mann–Whitney U检验比较EC组织与匹配的远癌非恶性组织之间的FGFRL1表达水平。使用ROC曲线分析评估诊断性能，并使用以下公式计算敏感性、特异性和阳性预测值（PPV）：敏感性 = TP/(TP + FN)，特异性 = TN/(TN + FP)，PPV = TP/(TP + FP)。使用χ2检验分析FGFRL1表达与ESCC患者临床病理参数之间的关联。P值≤ 0.05被认为具有统计学显著性。
相关性数据检索
使用Correlation R对TCGA数据集中可用的EC亚型（食管鳞状细胞癌和腺癌）数据库中FGFRL1与主要EMT标志物进行相关性分析。
结果
食管癌患者队列中FGFRL1的免疫组化分析
我们检查了FGFRL1蛋白在EC中的临床意义；在组织学正常（n = 34）、癌前（n = 51）、EAC活检样本（n = 14）和食管鳞状细胞癌活检样本（n = 41）中分析了其表达。代表性图像见图1，I。共分析了140个标本，发现FGFRL1在82.0%（87/106）的EC组织中表达上调，与匹配的远癌非恶性组织相比具有统计学显著性（P < 0.001，OR = 73.2）。我们发现癌前组织（72.5%）、ESCC（92.8%）和EAC亚组（90.2%）中的FGFRL1阳性率显著高于远癌非恶性组织（P = 0.002）（图1，II & III）。我们观察到FGFRL1蛋白在癌前和EC组织的细胞质和细胞膜中表达。在非恶性组织切片中未检测到FGFRL1的表达（图S3）。ROC曲线分析显示，区分EC组织与远癌非恶性组织的AUC为0.817，敏感性最高为82.0%，特异性为94.1%，阳性预测值为0.82（图2，I & II）。EC标本的临床病理参数及其与FGFRL1表达的相关性见表1。χ2分析显示FGFRL1表达与部位、年龄、性别、放疗和化疗无显著关联。只有烟草（P = 0.002）与FGFRL1表达显著相关，表明吸烟者更可能有高表达。未观察到FGFRL1表达与其他习惯（即饮酒、喝茶、食用油或辣椒消费）有显著关联（表1）。
FGFRL1敲低影响食管癌细胞中的主要信号通路
为了证明FGFRL1表达在人EC中的功能作用，我们使用RNAi方法沉默了食管癌细胞系（KYSE410）中的FGFRL1。接下来，记录了FGFRL1敲低后的mRNA和蛋白质表达水平。
与转染乱序siRNA的细胞相比，转染FGFRL1特异性siRNA的细胞在48小时后显示FGFRL1的mRNA表达显著降低73%（P ≤ 0.01），蛋白质表达水平降低71%（P ≤ 0.01）（图3A，B）。接下来，通过Illumina新一代测序进行转录组分析以研究mRNA谱的变化。共记录了795个转录本为显著DEGs。此外，使用DESeq2软件检查FGFRL1敲低组中的差异表达，其中121个DEGs上调，236个下调。此外，有43个FGFRL1敲低组特异性基因和51个对照组特异性基因。差异表达基因在重复样本中的表达谱显示在火山图中（图3C）。
使用Funrich工具和Enricher工具（使用KEGG 2021 Human数据库、Human Molecular Signatures Database (MSigDB Hallmark) 2020和Mammalian Phenotype (MP) Ontology (MGI), 2021）分析下调的DEGs和对照组特异性基因（图3D，E）。FGFRL1敲低后，几个致癌通路如Focal adhesion、p53信号通路和PI3K-Akt通路被发现是主要的下调信号网络。MSigDB Hallmark数据库特别显示下调的DEGs参与EMT、缺氧和其他主要致瘤通路。Mammalian Phenotype (MP) Ontology数据库显示FGFRL1敲低可能导致肿瘤生长和大小减少。
接下来，使用Ingenuity Pathway Analysis软件（IPA, QIAGEN）探索DEGs的PPI网络及其功能通路行为。处理显著下调的基因和对照组特异性基因，所有聚类根据顶点权重、复杂预测和可选的过滤后处理进行评分。选择最高得分的聚类如图4A所示。该聚类中的基因与PI3K Akt信号和上皮-间质转化（EMT）事件相关。
首先，我们验证了FGFRL1敲低KYSE410细胞后该聚类基因的差异表达，观察到CDK4、IKBKE、FYN、EPSAI、ITGA4和INHBA的mRNA表达显著降低（P < 0.001）（图4B）。进一步，分析这些基因的下游预测网络，预测它们表达下调可触发肿瘤细胞凋亡并降低细胞运动能力（图4C）。
由于发现聚类基因参与PI3K-Akt信号，该信号在EMT、转移和侵袭中起主要作用，我们探讨了FGFRL1敲低对下游信号通路如PI3K-Akt、Notch通路和EMT过程的影响。我们发现FGFRL1敲低显著降低了磷酸化Akt和磷酸化GSK3β的表达。此外，与对照转染后48小时相比，间质标志物如Snail、N-cadherin、Vimentin、Zeb1、β-catenin和Slug的蛋白质水平降低，而上皮标志物E-cadherin的表达显著增加（P < 0.05）（图5A–D）。
此外，发现KYSE410细胞中FGFRL1表达降低与Notch信号失活相关，Notch配体JAG1、DLL1、DLL4以及受体NOTCH1和NOTCH2，以及靶基因HES1的表达减少，通过qRT PCR定量证实（P < 0.05）（图5E）。
为了补充这些结果，我们在
