乳腺癌是一个重大的全球公共卫生挑战，它是女性中最常见的癌症之一，也是导致女性癌症相关死亡的主要原因[[1], [2], [3]]。乳腺癌的治疗已经取得了显著进展，目前有多种治疗药物可用于有效管理疾病。例如，来曲唑、槲皮素和比卡鲁胺是此类治疗策略中的关键成分[4,5]。来曲唑是一种强效的非甾体芳香化酶抑制剂，广泛用于绝经后妇女的激素受体阳性乳腺癌治疗[6]，通常与其他抗癌药物联合使用以提高整体治疗效果[7]。比卡鲁胺（BTM）是一种非甾体抗雄激素药物，通过阻断雄激素对癌细胞的作用发挥作用。虽然主要应用于前列腺癌治疗，但它也显示出对某些类型乳腺癌的潜在益处，尤其是那些表达雄激素受体的乳腺癌。通过抑制雄激素信号传导，比卡鲁胺可能有助于减缓肿瘤生长并改善治疗效果，尤其是在与其他激素或靶向疗法联合使用时[4,8]。槲皮素（QRN）是一种天然存在的多酚类黄酮，存在于多种蔬菜、茶叶和水果中，如莳萝、苹果、香菜、浆果、欧芹和刺山柑中，其中洋葱中的浓度最高，并具有多种健康益处[9,10]。在乳腺癌中，QRN表现出强大的抗氧化和抗炎作用，可以抑制肿瘤生长并诱导癌细胞凋亡。此外，QRN还被证明可以增强传统化疗药物的效果并减少其副作用，显示出作为乳腺癌治疗辅助药物的潜力[5,11]。尽管每种药物单独使用效果良好，但联合治疗显示出协同效应，能够提高治疗效果并减少耐药性[4,5,7,8]。这种协同效应增强了乳腺癌治疗的整体效果，强调了建立合适的分析工具的重要性。然而，由于人血浆和环境水等基质的复杂性和变异性，开发此类分析方法面临重大挑战。
药品残留物持续释放到水环境中已成为一个全球性问题，因为它们具有持久性、生物活性和潜在的生态影响。这些化合物通过家庭排放、工业废水以及污水处理设施中的不完全去除进入环境水体。即使在微量情况下，这些药品也可能导致抗菌素耐药性、内分泌干扰和长期生态压力，因此需要可靠的分析工具进行环境监测[[12], [13], [14], [15], [16]]。
已有多种分析技术被报道用于分别测定LTZ、BTM和QRN，包括液相色谱[[17], [18], [19]]、分光光度法[[20], [21], [22], [23]]和荧光光谱法[[24], [25], [26]]。据我们所知，目前尚无同时定量LTZ、BTM和QRN的单一方法。
传统的分析方法通常依赖于消耗大量有机溶剂的萃取技术。这些程序不仅耗时，而且由于使用有毒有机溶剂而存在明显的健康和环境风险。近年来，绿色分析化学原理在分析研究中越来越受到重视，这促进了生态友好和可持续方法的发展[27]。深度共晶溶剂（DESs）作为一种有前景的替代品出现，它们是通过氢键供体（HBD）和氢键受体（HBA）之间的相互作用形成的低分子量共晶混合物。由于DESs价格低廉、无害且可生物降解，因此非常适合绿色分析应用[28]。天然深度共晶溶剂（NaDESs）是指含有有机酸、糖类、氨基酸、胆碱衍生物或天然萜类等成分的DESs[29]。多项研究使用DESs从水、土壤、食品和生物样本中高效萃取和测定药品和重金属（如砷、硒和铬），具有较高的预浓缩因子，从而实现目标分析物的痕量分析[[30], [31], [32], [33], [34]]。相反，在过去的20年里，分散液-液微萃取（DLLME）得到了显著发展，成为制备微型样品的方法[32,35,36]。
质量设计（QbD）作为一种先进的系统方法，确保了可靠和经过验证的结果。将实验设计（DoE）纳入分析方法中，可以高效地开发和优化方法。与单变量方法相比，它可以通过较少的实验次数获得更多信息，从而全面优化实验变量[37,38]。这种方法符合当前设计环境可持续分析程序的重点，节省时间、金钱和溶剂。通过同时分析多个参数，DoE有助于确定它们对感兴趣响应的单独和交互效应[39,40]。采用QbD框架优化了关键萃取参数，包括DES体积、涡旋时间和盐的添加。将质量设计（QbD）原则纳入方法开发中，确保了方法的稳健性、可靠性和最佳分析性能。
本文中，使用由正辛醇和正丙酸组成的疏水性天然DES，在注射器内涡旋辅助微萃取（VA-DLLME）技术中高效地同时萃取和测定了QRN、LTZ和BTM，并结合了HPLC-PDA。在本研究中，使用商用注射器作为封闭反应容器，样品和DES在其中混合。涡旋时有助于DES在样品中的分散，并通过推动活塞即可收集DES层，无需离心步骤，从而简化了萃取过程，节省了时间，并解决了富含分析物的DES相的分离难题。按照ICH建议，所提出的方法经过了彻底验证，在临床相关浓度范围内表现出优异的线性、精度、准确性和灵敏度。
随后对添加了目标药物的人血浆、药品制剂和环境水样品进行了检测，以验证该方法的适用性，表明其在质量控制、环境分析和治疗药物监测（TDM）中的潜在应用。
本研究报道了第一种用于同时定量抗癌组合药物（QRN、LTZ和BTM）的分析方法。它还首次应用了基于NaDES的VA-LLME方法，在HPLC-PDA分析前从各种复杂基质中同时萃取这些药物。与现有的基于DES的DLLME-HPLC方法相比，该方法具有许多实际和分析优势。它采用了一种生物相容的NaDES系统，并结合了注射器内涡旋辅助分散步骤，显著改善了分散效果，提高了萃取效率，并消除了DES相分离所需的离心步骤，大大缩短了整体萃取时间。其次，通过QbD方法系统优化了萃取参数，确保了方法的稳健性和重复性。第三，该方法实现了目标分析物的快速HPLC分析，使得在不到十分钟内即可高效萃取和分析这些药物，提供了一种高效、环保且高通量的常规监测解决方案。这些特点明显区分了我们的方法，提供了比现有的基于DES的DLLME HPLC技术更快、更简单、更高效的替代方案。
