《Communications Chemistry》：Rapid vinyl thianthrenium tetrafluoroborate-promoted thioacid-based native chemical ligation and its applications in chemical protein synthesis
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本刊推荐：为解决传统天然化学连接(NCL)反应中肽烷基硫酯反应活性低、需过量添加剂的问题，研究人员开发了乙烯基噻蒽四氟硼酸盐(VTT)促进的硫基酸无添加剂连接新策略。该策略可在酸性条件下实现完全未保护C端肽硫基酸的定量活化，生成高反应活性硫酯中间体，实现无添加剂快速NCL反应，且与后连接脱硫反应兼容，成功应用于hyalomin-3和泛素的一锅法合成，为化学蛋白质合成提供了更高效环保的新方法。
在生命科学领域，蛋白质作为生命活动的主要执行者，其精确合成一直是科学家们追求的目标。化学蛋白质合成(Chemical Protein Synthesis, CPS)通过化学选择性地连接合成肽片段，能够在任意位点引入非天然氨基酸、生物物理探针或特定翻译后修饰，为获得均一性目标蛋白提供了强大工具。在众多连接策略中，由Kent团队于1994年提出的天然化学连接(Native Chemical Ligation, NCL)因其高效性成为应用最广泛的连接方法。
然而，传统NCL方法存在明显局限性：一方面其依赖半胱氨酸(Cys)作为连接位点，而Cys在蛋白质中含量较低(仅1.7%)；另一方面，常用的肽烷基硫酯反应活性较低，往往需要添加大量亲核添加剂(如MPAA)来促进反应，这些添加剂又会干扰后续的无金属脱硫(Metal-Free Desulfurization, MFD)过程，导致操作复杂化。虽然已有多种替代添加剂被开发，但过量添加剂的使用仍然不可避免，这不仅影响原子经济性，也限制了合成效率的进一步提升。
针对这些挑战，福建医科大学刘家安团队在《Communications Chemistry》发表了一项创新性研究，开发了一种基于乙烯基噻蒽四氟硼酸盐(Vinyl Thianthrenium Tetrafluoroborate, VTT)促进的硫基酸无添加剂天然化学连接(VTANCL)新策略。该方法突破了传统NCL对添加剂的依赖，实现了高效、快速且无外源添加剂的肽段连接，为化学蛋白质合成提供了新的技术路径。
研究团队采用的关键技术方法包括：VTT促进的硫基酸酯化反应、无添加剂天然化学连接反应、一锅法串联反应技术(硫酯化-连接-脱硫)、Knorr吡唑化学法制备肽硫基酸，以及高效液相色谱(HPLC)和质谱(MS)分析技术。所有肽段均通过固相肽合成(Fmoc-SPPS)制备。
反应设计与概念验证
研究团队发现，在酸性NCL条件下，VTT能够定量、选择性地将完全未保护的C端肽硫基酸转化为相应的无差向异构化硫酯。这种基于硫基酸的无添加剂NCL策略(VTANCL)充分利用了噻蒽基团的良好离去能力，生成的硫酯中间体表现出极高的反应活性，无需任何添加剂即可快速完成NCL反应。
通过系统优化反应条件，研究团队确定了最佳反应体系：在pH 5.0的6.0 M Gn·HCl/0.2 M磷酸盐缓冲液中，加入20% DMF作为共溶剂，使用1.2当量VTT，25°C反应2小时即可实现硫基酸的定量转化。与传统的MPAA硫酯相比，VTT活化生成的肽酰噻蒽硫酯(2a)表现出相当的甚至更优的连接动力学，在5分钟内即可达到85%以上的转化率。
化学选择性研究
研究团队系统评估了VTANCL策略的化学选择性。在弱酸性反应条件下，碱性氨基酸残基(Lys、His、Arg)的侧链因质子化而失去亲核性，不会与VTT发生反应。同样，丝氨酸(Ser)、酪氨酸(Tyr)等含羟基氨基酸的侧链也因亲核性较低而保持稳定。即使存在所有可能反应性侧链(除Cys外)的复杂体系中，VTT仍能特异性识别硫基酸并完成选择性酯化。
特别值得注意的是，通过调节反应pH值(pH 2.0-3.0)，VTANCL策略能够实现硫基酸与Cys硫基之间的高选择性，这归因于硫基酸较低的解离常数(pKa≈3)与Cys硫基较高pKa值(8.0-8.5)的差异。这一特性使得该方法在含Cys的复杂肽段体系中仍能保持高效和特异性。
差向异构化测试
差向异构化是肽段连接过程中需要严格控制的副反应。研究团队通过合成C端为丝氨酸(Ser)、苯丙氨酸(Phe)和丙氨酸(Ala)的系列硫基酸肽段，并对比其L型和D型异构体在VTANCL过程中的行为，证实该方法能够完全保持C端氨基酸的手性完整性。高效液相色谱分析显示，L型和D型异构体在硫酯化和连接步骤后均保持其构型不变，无任何差向异构化产物检测。
VTANCL策略的适用范围
研究团队系统考察了VTANCL策略对不同C端氨基酸的适用性。结果表明，该方法对大多数蛋白源性氨基酸都具有良好的兼容性，产率在86%-98%之间。特别是对于传统NCL中反应性较差的空间位阻氨基酸(如缬氨酸Val、异亮氨酸Ile、脯氨酸Pro)，VTANCL策略仍能实现有效连接，其中Val和Ile仅需2小时即可完成反应，Pro在24小时内也能获得可接受的产率。这一广谱的适用性大大拓展了该方法在复杂蛋白质合成中的应用前景。
基于VTANCL的Hyal-3和泛素全合成
为验证VTANCL策略的实际应用价值，研究团队成功合成了具有抗凝血活性的hyalomin-3(Hyal-3)和模型蛋白泛素(ubiquitin)。Hyal-3的合成采用一锅法硫酯化-连接-脱硫策略，三个步骤连续进行，无需中间纯化，最终以56.8%的总产率获得目标蛋白。
更为重要的是，研究团队通过一锅法C-to-N顺序三片段缩合策略成功合成了76个氨基酸组成的泛素蛋白。该合成过程涉及六个连续步骤：第一片段硫酯化、第一次连接、Thz保护基脱除、第二片段硫酯化、第二次连接以及最终脱硫反应。所有步骤均在同一反应容器中完成，最终以28.2%的分离产率获得全长泛素蛋白，充分展示了VTANCL策略在复杂多片段蛋白质合成中的高效性和实用性。
该研究开发的VTANCL策略代表了化学蛋白质合成领域的重要进展。与传统方法相比，其最大优势在于完全避免了添加剂的使用，这不仅简化了操作流程，提高了原子经济性，还显著增强了对后续脱硫反应的兼容性。特别是其出色的反应速率和广谱的底物适用性，使得该方法特别适合于复杂蛋白质的多片段合成。此外，肽硫基酸作为硫酯前体的使用，为蛋白质合成提供了更加稳定和易于制备的中间体。
这项研究不仅为解决长期困扰化学蛋白质合成的添加剂问题提供了创新性解决方案，也为合成含有复杂修饰或非天然氨基酸的蛋白质靶标开辟了新途径。随着后续研究的深入，VTANCL策略有望成为化学蛋白质合成工具箱中的重要组成部分，推动合成生物学、药物开发和生物材料等领域的进一步发展。
