《Plant Physiology and Biochemistry》：Carbonylation-dependent protein degradation is a prerequisite for dormancy alleviation of apple (
Malus domestica Borkh.) seed
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本研究针对苹果种子深度休眠解除机制，通过冷层积处理发现胚胎轴中蛋白质羰基化水平呈现先升后降的时序性变化。研究人员系统鉴定了17种羰基化蛋白（包括11S球蛋白、SBP65等），证实20S蛋白酶体途径在低ATP条件下主导碳酰化蛋白降解，并揭示其通过调控储存蛋白降解、激素信号转导等分子事件推动休眠解除。该研究首次在深度休眠种子中阐明ROS介导的蛋白质组重塑机制，为种子萌发调控提供了新视角。
苹果（Malus domestica Borkh.）种子具有典型的深度生理休眠特性，其离体胚胎萌发率低，幼苗发育存在子叶不对称生长、胚轴缩短等异常现象。生产实践中常采用5°C冷层积处理破除休眠，但其中涉及的分子调控机制尚未完全阐明。近年来研究表明，活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）在种子休眠解除中发挥关键信号作用，其通过蛋白质翻译后修饰（如碳酰化）调控蛋白质功能，但该过程在深度休眠种子中的具体机制仍是空白。
为解析这一科学问题，华沙生命科学大学植物生理学系的Katarzyna Ciacka团队在《Plant Physiology and Biochemistry》发表了创新性研究。该工作以苹果种子胚胎轴为材料，通过设置0（休眠对照）、7、14、21和40天（休眠完全解除）五个冷层积时间点，系统探究了蛋白质羰基化动态变化规律及其与蛋白质降解途径的关联。研究首次发现羰基化修饰在苹果种子休眠解除过程中具有时间特异性和蛋白质特异性，并证实碳酰化蛋白的降解是休眠解除的先决条件。
关键技术方法包括：通过酶联免疫吸附法测定蛋白质羰基含量；采用二维电泳结合免疫印迹技术鉴定碳酰化蛋白；使用特异性底物检测蛋白酶体和总蛋白酶活性；通过生物素 blotting 分析生物素化蛋白谱；利用ATP检测试剂盒定量细胞能量状态。
研究结果揭示三个核心发现：
- 1.
蛋白质羰基化动态变化规律：冷层积7-14天时胚胎轴碳酰化蛋白含量显著升高（1.7倍），21-40天时下降至休眠水平以下。这表明早期ROS累积触发蛋白质氧化修饰，后期通过激活降解机制清除修饰蛋白。
- 2.
碳酰化蛋白组图谱特征：共鉴定出17种碳酰化蛋白，包括11S球蛋白、种子生物素结合蛋白（SBP65）、胚胎发育丰富蛋白（LEA）等。其中11S球蛋白在各级层积阶段均出现碳酰化片段，提示其作为储存蛋白在休眠解除中优先被标记降解。特别发现14天层积时赤霉素2-β-双加氧酶（GA2ox1）等激素相关蛋白的碳酰化，可能通过调节赤霉素代谢促进休眠解除。
- 3.
蛋白质降解机制转换：20S蛋白酶体活性在层积7天即显著激活，且不依赖ATP水平变化；而总蛋白酶活性在21天后才明显上升，40天时伴随ATP含量增加25%，表明后期可能启动26S蛋白酶体途径。这种降解途径的时序性转换与碳酰化蛋白的清除动态高度吻合。
特别值得关注的是，研究发现生物素化蛋白在休眠解除后期发生显著变化：>250 kDa大分子蛋白生物素化增强，而60-100 kDa蛋白修饰水平下降，提示生物素代谢重分布可能通过影响羧化酶活性参与能量代谢调控。此外，碳酰化的蛋白二硫键异构酶（PDI）和热休克蛋白（HSP70）的发现，表明蛋白质质量控制系统的氧化修饰可能是调控蛋白酶体功能转换的关键开关。
讨论部分深入阐释了碳酰化蛋白降解的生理意义：一方面通过清除失效蛋白（如LEA蛋白、储存蛋白）为萌发提供底物；另一方面通过修饰信号蛋白（如GA2ox1、钙结合蛋白）主动调控休眠相关通路。研究提出的"氧化窗口"理论进一步完善了ROS信号作用模型：早期碳酰化标记冗余蛋白，后期通过20S/26S蛋白酶体途径有序降解，形成推动休眠解除的分子驱动力。
该研究的创新性在于首次在深度休眠种子中构建了蛋白质碳酰化-降解通路的作用框架，揭示了低温层积通过ROS信号介导蛋白质组重塑的分子级联反应。这不仅为种子休眠生理研究提供了新范式，也为农业生产中种子萌发调控技术的开发奠定了理论基础。
