《Sensors and Actuators Reports》：Cascaded and autocatalytic dumbbell probe for exponentially amplified and label-free highly-sensitive fluorescent biosensing of miRNA from cancer cells
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本研究针对microRNA（miRNA）检测中存在的低丰度、序列相似性高、传统方法灵敏度不足等问题，开发了一种结合杂交链式反应（HCR）、DNAzyme切割和滚环扩增（RCA）的级联自催化哑铃探针系统（HCRD-RCA），用于高灵敏度、无标记检测miRNA-21。该方法通过目标miRNA触发DNAzyme的生成与循环切割，释放引物S1启动RCA，指数级生成G-四链体结构，结合硫磺素T（ThT）产生强荧光信号，检测限低至0.155 fM，并成功应用于血清和癌细胞样本中miRNA-21的定量分析，为癌症早期诊断提供了新工具。
在癌症研究领域，微小核糖核酸（microRNA, miRNA）作为重要的调控分子，已成为疾病诊断和预后评估的关键生物标志物。尤其是miRNA-21，其在乳腺癌等多种恶性肿瘤中异常高表达，与肿瘤的增殖、侵袭及不良预后密切相关。然而，由于miRNA在生物样本中含量极低、序列高度相似且易降解，传统检测方法如Northern印迹、微阵列和实时定量PCR（qRT-PCR）往往存在操作繁琐、灵敏度不足、依赖昂贵仪器或易受背景干扰等问题，难以满足临床早期诊断的需求。因此，开发高灵敏度、高特异性且易于操作的miRNA检测新技术成为当前研究的热点。
针对这一挑战，重庆理工大学药学院的钟敏、肖念庭、唐雅琴等研究人员在《Sensors and Actuators Reports》上发表了一项创新性研究，提出了一种名为“HCRD-RCA”的级联自催化哑铃探针策略，实现了对miRNA-21的无标记、指数放大荧光检测。该方法巧妙地将杂交链式反应（Hybridization Chain Reaction, HCR）、DNAzyme（脱氧核酶）介导的切割反应和滚环扩增（Rolling Circle Amplification, RCA）三者整合于一体，通过多级信号放大机制，显著提升了检测的灵敏度和特异性。
为开展本研究，作者主要运用了几项关键技术：首先，设计了可被miRNA-21触发的发夹探针H1和H2，通过HCR反应原位生成具有切割活性的DNAzyme；其次，构建了具有双结合位点的哑铃型探针STD-5，用于引导RCA反应；最后，利用硫磺素T（ThT）与RCA产物中重复形成的G-四链体（G-quadruplex）结合产生荧光信号，实现无标记检测。实验还涉及非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）验证反应过程，以及荧光光谱法进行定量分析。所有检测均在复杂基质（如人血清和MCF-7、HeLa癌细胞提取物）中进行，以评估方法的实际应用能力。
3.1. 方案的工作原理
本研究的核心设计在于其级联放大机制。当目标miRNA-21与发夹探针H1结合后，暴露出原本被封闭的DNAzyme形成序列（DS）。DS与另一发夹探针H2杂交，在Mg2+存在下激活DNAzyme，切割H2并释放引物S1，同时DS再生以启动新一轮切割，形成自催化循环。随后，S1与哑铃探针STD-5结合，在Bst DNA聚合酶催化下启动RCA，生成包含多次重复序列的长链DNA。这些重复序列可折叠成大量G-四链体结构，后者与荧光染料ThT结合后产生显著增强的荧光信号，从而实现对miRNA-21的高灵敏度检测。
3.2. 可行性验证
通过Native-PAGE和荧光光谱分析，作者验证了HCRD-RCA系统的可行性。凝胶电泳结果显示，仅在miRNA-21存在时，H1与H2反应产生低分子量条带（对应S1），且RCA产物在加样孔附近出现拖尾现象，表明成功扩增。荧光实验进一步证实，miRNA-21可诱导荧光强度增强约20倍，而空白对照组信号微弱，验证了该策略的特异性和有效性。
3.3. 反应条件优化
为最大化检测性能，作者系统优化了关键反应参数。结果表明，当H1与H2摩尔比为1:3、Mg2+浓度为100 mM、dNTPs浓度为125 μM、Bst DNA聚合酶用量为4 U、RCA反应时间为60分钟时，荧光信号最强，信噪比最高。这些优化条件为后续灵敏度和选择性分析奠定了基础。
3.4. 分析性能评估
在最优条件下，该策略对miRNA-21的检测线性范围为10 fM至10 nM，检测限低至0.155 fM（基于3σ准则），灵敏度显著优于多数已报道的扩增方法。荧光强度与miRNA-21浓度的对数呈现良好的线性关系（R2= 0.9951），表明该方法适用于痕量miRNA的定量检测。
3.5. 选择性分析
选择性实验显示，即便在多种干扰miRNA（如单碱基错配序列Mis1-Mis4、miRNA-155、miRNA-210等）共存的情况下，该体系仅对miRNA-21产生显著荧光响应，错配序列引发的信号可忽略不计。此外，目标与干扰物的混合样本检测结果与单独检测miRNA-21时一致，证明方法具有优异的抗干扰能力和单核苷酸区分能力。
3.6. 实际样本分析
在加标回收实验中，该方法在10%人血清中对miRNA-21的回收率达98.5%–100.9%，相对标准偏差（RSD）为2.8%–4.58%，显示其在复杂生物基质中的可靠性。进一步地，作者应用该策略检测了MCF-7（乳腺癌）和HeLa（宫颈癌）细胞中的内源性miRNA-21表达水平。结果表明，MCF-7细胞的荧光信号随细胞数量（100–10,000个）增加而升高，而HeLa细胞即使在高细胞数下仍信号微弱，与文献报道的miRNA-21在乳腺癌细胞中高表达的特征相符，验证了方法在真实生物样本中的适用性。
综上所述，本研究开发的HCRD-RCA策略通过级联放大与自催化设计，实现了对miRNA-21的超灵敏、无标记检测。该方法不仅具备检测限低、选择性好、操作简便等优点，还能在血清和癌细胞裂解液等复杂环境中稳定工作，清晰区分不同癌细胞的miRNA表达差异。这一技术为miRNA相关癌症早期诊断、预后监测及基础研究提供了强有力的工具，尤其适用于临床样本中低丰度生物标志物的精准分析。未来，通过调整探针序列，该平台还有望拓展至其他疾病特异性miRNA的检测中，展现出广阔的应用前景。
