《Theriogenology Wild》：The effect of extended cold storage and the use of extenders on motility and swimming kinematics of shortnose sturgeon sperm
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本研究针对濒危物种短吻鲟（Acipenser brevirostrum）精子获取困难、短期储存方案缺乏的问题，系统评估了不同稀释剂（如Park and Chapman、改良Tsvetkova extender）及氧气环境对精子活力（Motility）和运动动力学（VCL, LIN, WOB）在4°C低温储存下的影响。结果表明，改良Tsvetkova稀释剂能显著延长精子活力至24天，且污染风险更低，为鲟鱼辅助生殖及野外精子库建立提供了关键技术支撑。
鲟鱼，这个被称为“水中活化石”的古老鱼类家族，如今正面临着前所未有的生存危机。由于过度捕捞（特别是为了获取珍贵的鱼子酱）、栖息地碎片化（如水坝建设）、水质污染等多重威胁，全球所有27种鲟鱼均被世界自然保护联盟（IUCN）列入红色名录，使其成为世界上最濒危的脊椎动物类群。其中，短吻鲟（Acipenser brevirostrum）的处境尤为严峻，在加拿大被列为特别关注物种，在美国更早被列为濒危物种。对于这类濒危物种的保护，除了在原栖息地采取保护措施（就地保护）外，迁地保护（Ex situ conservation）也扮演着至关重要的角色，尤其是在人工环境下进行辅助繁殖。然而，辅助繁殖技术的成功实施面临着一个关键瓶颈：野生鲟鱼精子获取极为困难，不仅因为种群数量稀少，还因其繁殖季节短暂，且雄性和雌性个体的生殖周期难以同步。因此，如何有效地短期储存精子，使其在需要时仍能保持受精能力，就成为鲟鱼保育和人工繁殖研究中的一个核心问题。低温（通常为4°C）储存是一种相对简便、成本较低的短期保存方案，但精子在储存过程中活力会逐渐下降。为了延缓这一过程，科学家们会使用一种称为“稀释剂”（Extender）的溶液，其目的是模拟精浆成分，为精子提供适宜的环境和能量，防止其被过早激活并维持细胞活力。尽管已有一些稀释剂被用于其他鲟鱼物种，但针对短吻鲟精子短期储存的系统性研究仍较为缺乏。此外，氧气作为细胞有氧呼吸的必需物质，其补充是否有利于精子长期储存，以及储存过程中可能出现的微生物污染问题，都值得深入探讨。为了解决这些问题，为短吻鲟乃至其他鲟鱼的保护工作提供切实可行的技术方案，研究人员开展了此项研究，相关成果发表在《Theriogenology Wild》上。
本研究主要采用了以下关键技术方法：研究人员于2022年和2023年的5月繁殖季节，在加拿大新不伦瑞克省沃拉斯托克河（Wolastoq River）通过刺网捕捞野生短吻鲟雄性个体（2022年5尾，2023年4尾）并采集精液。实验设计了两种方案：实验一比较了Hank平衡盐溶液（HBSS）、Park and Chapman稀释剂以及不添加稀释剂的对照组对精子在4°C下储存7天内的影响；实验二则进一步比较了Park and Chapman稀释剂、改良Tsvetkova稀释剂以及对照组，并增加了有氧和无氧环境的对比，观察时间延长至24天。精子活力（Motility）和运动动力学参数，包括曲线速度（VCL, Curvilinear Velocity）、线性度（LIN, Linearity）和摆动性（WOB, Wobble），均通过计算机辅助精子分析（CASA）系统进行精确量化。所有统计分析均使用R语言完成。
3.1. Experiment 1
实验1的结果显示，储存时间对所有测试参数（活力、VCL、LIN、WOB）均有显著的负面影响，其数值随着储存天数的增加而总体下降。在稀释剂效果方面，Park and Chapman稀释剂和HBSS稀释剂处理组的精子曲线速度（VCL）下降速度显著慢于未使用稀释剂的对照组。这表明稀释剂在一定程度上起到了保护精子运动能力的作用。然而，在7天的观察期内，不同处理组之间精子保持活力的最后一天并无统计学上的显著差异。就活力下降百分比而言，Park and Chapman稀释剂处理组的活力下降最小（41.21%），而未使用稀释剂的对照组下降最大（72.38%）。
3.2. Experiment 2
实验2的结果更为深入。储存时间同样对所有参数产生了显著的负面影响。更重要的是，发现了储存天数与稀释剂种类之间存在显著的交互作用。具体而言，在储存初期（第3天），Park and Chapman稀释剂处理组的精子在LIN和WOB参数上显著优于改良Tsvetkova稀释剂组，其VCL也显著高于对照组。到了第10天，两种稀释剂处理组的精子在VCL、LIN和WOB上均显著优于未使用稀释剂的对照组。在评估精子保持活力的持续时间（即最后一天检测到VCL >10 μm/s）时，稀释剂显示出显著效应：使用Park and Chapman或改良Tsvetkova稀释剂的精子，其活力维持时间显著长于未处理组。尤为重要的是，虽然所有组的精子活力最终都降至很低水平（<5%），但改良Tsvetkova稀释剂处理组的精子是唯一在储存24天后仍能检测到微弱活力的。关于氧气的影响，统计分析未发现氧气处理对精子参数有显著影响。在污染观察方面，研究发现使用Park and Chapman稀释剂的样品在储存后期（约第17天起）更容易出现原生动物污染，而改良Tsvetkova稀释剂表现出相对较低的污染倾向。
3.3. Osmolality and pH measurements
研究人员测量了所用稀释剂的渗透压（Osmolality）和pH值。改良Tsvetkova稀释剂的pH为7.7，渗透压为68 mOsm/kg；Park and Chapman稀释剂的pH为7.6，渗透压为108 mOsm/kg。这些值均落在本研究中测得的短吻鲟精浆的渗透压（40-147 mOsm/kg）和pH（7.95-8.68）范围之内，说明所使用的稀释剂在理化性质上与精浆环境较为接近。
4. Discussion
研究结论与讨论部分对结果进行了深入解读。本研究的核心目标是确定一种能够有效维持短吻鲟精子短期储存后活力和运动能力的方案。综合两个实验的结果，可以得出以下主要结论：首先，使用稀释剂（无论是Park and Chapman还是改良Tsvetkova）总体上优于不使用的对照组，能更有效地延缓精子活力和运动能力的下降。其次，在储存初期（前7天），Park and Chapman稀释剂在维持精子活力方面表现最佳。然而，从长期储存（超过10天）的角度看，改良Tsvetkova稀释剂更具优势，它能使精子活力维持更长时间（直至24天），并且表现出更低的原生动物污染风险，这使其成为更实用的选择。第三，补充纯氧在本次研究中并未显示出显著的积极效果，但其在更长时间储存中可能存在的微弱益处以及与污染风险的权衡需要进一步研究。值得注意的是，即使不添加任何稀释剂，短吻鲟精子在4°C下也能维持一定活力长达21天，这为在野外条件受限时进行短期储存和运输提供了可能性。讨论中还指出了不同研究对精子“活力”定义（如VCL阈值设定）的差异，强调了统一标准对于跨研究比较的重要性。此外，原生动物污染被确定为影响精子长期储存的一个重要限制因素，改良Tsvetkova稀释剂在抗污染方面的潜在优势值得关注。研究人员也建议未来研究可考虑增加样品晃动以改善氧气和养分分布，以及尝试添加抗生素来控制污染。
总之，这项研究系统地评估了不同稀释剂和氧气环境对濒危物种短吻鲟精子短期低温储存效果的影响。其重要意义在于为鲟鱼辅助生殖和保育实践提供了关键的技术参考。研究明确指出，针对不同的储存时长需求，可以选择不同的稀释剂策略：若需短期（约7天）维持较高活力，Park and Chapman稀释剂是优选；若目标是尽可能延长储存时间（至24天），则改良Tsvetkova稀释剂更为理想，且其较低的污染倾向增加了应用的可靠性。这些发现不仅直接服务于短吻鲟的保护，其方法和结论也对其他濒危鱼类精子的保存研究具有借鉴意义。该研究突出了在野外环境下建立简单、有效精子短期储存协议的可行性，这对于克服鲟鱼生殖材料获取的时空限制，推动鲟鱼种群恢复和可持续管理具有重要的实践价值。
