从Cinnamomum tamala的乙醇提取物中分离出的植物化学物质能够诱导人类乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7的细胞周期停滞、DNA损伤以及细胞凋亡

《Tissue and Cell》：Phytochemicals in ethanolic extract of Cinnamomum tamala induce cell cycle arrest, DNA damage and apoptosis in human breast cancer cell lines MDA-MB-231 and MCF-7

印度月桂叶乙醇提取物（EECTL）经HPLC鉴定含儿茶素、丁香油等活性成分，对乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7具有剂量依赖性细胞毒性（IC50分别为47和110 μg），选择性指数5.69和8.16，诱导G0/G1期阻滞及凋亡，上调TP53表达，DNA损伤由彗星实验证实，未显著影响正常细胞。本研究首次揭示EECTL对乳腺癌细胞的抗癌机制，为整合疗法提供依据。

作者：Ishrat Husain、Anu Chandra、Mrinal Ranjan Srivastava、Farzana Mahdi、Rumana Ahmad

印度勒克瑙Era医学院与医院生物化学系，地址：Sarfarazganj, Hardoi Road, Lucknow-226003

摘要

Cinnamomum tamala（简称CT），在印地语中被称为“Tejpatta”，属于樟科植物，是一种具有显著药用特性的烹饪调味品。本研究通过HPLC对干燥CT叶子的乙醇提取物（EECTL）进行了表征。利用DPPH自由基清除试验评估了其抗氧化活性，通过圆盘扩散法评估了其抗菌潜力。通过MTT试验和相位对比显微镜观察分析了EECTL对人类乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7以及正常HEK293和Vero细胞的抗癌作用。通过荧光显微镜下的Hoechst和AO/EtBr染色以及qRT-PCR分析研究了EECTL诱导的染色质凝聚和细胞凋亡。利用流式细胞术进行了Annexin V-FITC-PI双染色以检测细胞凋亡并分析细胞周期。研究发现儿茶素（R_t = 6.085分钟）、丁香酚（R_t = 7.211分钟）和阿皮苷（R_t = 19.496分钟）是主要的生物活性成分。EECTL以剂量依赖的方式诱导MDA-MB-231和MCF-7细胞系发生凋亡，其IC₅₀值分别为47微克和110微克。有趣的是，EECTL对正常HEK-293和Vero细胞没有显著影响。EECTL对Vero/MDA-MB-231和HEK-293/MDA-MB-231的选择性指数分别为5.69和8.16，而对Vero/MCF-7和HEK-293/MCF-7的选择性指数分别为2.43和3.48。机制上，EECTL在MDA-MB-231中导致G₀/G₁期细胞周期停滞，在MCF-7中导致亚G₀期细胞周期停滞，从而引发染色质凝聚和细胞凋亡。彗星试验证实了DNA损伤和片段化。表达分析显示EECTL上调了MDA-MB-231和MCF-7细胞中的TP53表达。EECTL对DPPH具有显著的抗氧化作用，其IC₅₀值为150微克/毫升。本研究首次报道了EECTL对乳腺癌MDA-MB-231细胞的抗癌作用及其作用机制。EECTL有望作为乳腺癌治疗的辅助手段，并可能为未来的临床前和临床研究提供新的方向。

引言

根据GLOBOCAN 2022的数据，肺癌和女性乳腺癌是全球最常见的癌症类型，分别占新发病例的12.4%和11.6%（GLOBOCAN, 2022）。在美国，乳腺癌是女性中仅次于皮肤癌的第二大癌症。2022年，印度有105.4/100,000的女性被诊断出患有乳腺癌（Srivastava等人，2024）。国际癌症研究机构（IARC）指出，在人类发展指数（HDI）较高的国家，每12名女性中就有1人会患上乳腺癌，每71名女性中有1人因此死亡；而在HDI较低的国家，这一比例分别为1/27和1/48。

由于目前所有的乳腺癌治疗策略都存在不同程度的局限性以及不同程度的副作用，因此需要从各个方面改进和加强现有的治疗方法。为此，有必要深入研究乳腺癌的分子机制，并寻找新的治疗手段。

除了化疗、放疗或手术外，自古以来草药就被用作预防和治疗癌症的替代和补充方法。目前临床实践中使用的许多抗肿瘤药物都来源于天然植物。例如，长春新碱（Catharanthus roseus）、多西他赛（Taxus baccata）、紫杉醇（Taxus brevifolia）、依托泊苷、依托泊苷（Podophyllum peltatum）、秋水仙碱（Colchicum autumnale等（Iqbal等人，2017；Weawer，2014；Caruso等人，2000；Dehelean等人，2021；Fridlender等人，2015）。

阿育吠陀（Ayurveda）是印度传统的医学体系，包含了许多具有经验证药用特性的植物及其成分，如预防、免疫调节和治疗作用（Verma等人，2024）。低毒性、高选择性、通过多种途径发挥多重作用（多效性）以及可重新利用的特性，是寻找和开发活性成分时的挑战。许多草药及其不同部位在印度被用作香料和调味品。除了烹饪用途外，这些草药在阿育吠陀中还因其药用价值而被使用（Ahmad等人，2020）。许多这类草药的提取物在体外和体内研究中显示出显著的抗癌潜力，因为它们含有生物活性成分，如生物碱、萜类、黄酮类、苯丙素类、花青素等。这些次生代谢物能够在细胞水平上清除自由基，从而提供保护和治疗多种疾病的作用。

Cinnamomum tamala（CT）属于樟科植物（补充图1a），在印地语中称为“Tejpatta”（Upadhyay，2017）。CT具有芳香叶片，在印度大部分地区都有分布（Ahmad等人，2020）。古代阿育吠陀和乌纳尼医学文献记载了这种植物的多种益处。

该植物的叶片（补充图1b）富含锰、铁、膳食纤维和钙，常用于为各种菜肴调味。除了烹饪用途外，自古以来这些叶片还被传统上用作草药，用于治疗多种疾病，尤其是发热和不适。干燥的CT叶片对免疫系统、胃肠道、肝脏等具有显著效果，可用于治疗风湿病、结肠炎、腹泻、恶心和呕吐等慢性及急性疾病。此外，CT叶片还具有抗真菌和杀虫作用，可对抗蚊蚋、蝴蝶幼虫、果蝇和火蚁。

由于含有肉桂醛和肉桂酸等活性成分，CT叶片对癌症、炎症、心脏保护和神经系统疾病具有显著的治疗效果（Hariri & Ghiasvand，2016）。

本研究制备了CT叶子的乙醇提取物（EECTL），并利用HPLC对其进行了植物化学表征，随后评估了其对人类乳腺癌细胞系MDA-MB 231和MCF-7的生物活性。同时评估了其对正常肾上皮细胞系Vero和HEK-293的毒性。令人鼓舞的结果为进一步测试该提取物对其他细胞系和动物模型的作用奠定了基础。这是首次报道EECTL对TNBC乳腺癌MDA-MB-231细胞的抗癌作用及其作用机制的研究，也表明CT是抗癌植物化学物质的良好来源。

EECTL的植物化学特性

图1(a)显示了EECTL的HPLC色谱图。确定了EECTL中存在的化合物的保留时间（R_t），并鉴定出三个主要峰：儿茶素（R_t = 6.085分钟）、丁香酚（R_t = 7.211分钟）和阿皮苷（R_t = 19.496分钟）。

EECTL对MDA-MB-231和MCF-7细胞的影响（与正常Vero和HEK-293细胞相比）

如图2(a)和(b)所示，含有EECTL（浓度为10-100微克/毫升和10-200微克/毫升）的MDA-MB-231和MCF-7细胞培养孔中的活细胞数量和颜色强度明显低于未处理细胞对照组。

讨论

CT叶片在印地语中被称为“bay leaves”和“tejpatta”。肉桂叶是最常用的烹饪香料之一，也用作观赏植物。干燥的肉桂叶传统上用于治疗胃肠道问题。多项体外研究表明，CT的乙醇、甲醇和水提取物具有抗癌作用（Ahmad等人，2020）。从CT叶片中分离出的酚类化合物如倍半萜内酯和甲基酯也显示出抗癌效果。

试剂

所有细胞培养试剂均为细胞培养级，与我们之前的研究所用试剂相同（Husain等人，2018；Srivastava等人，2024）。所有HPLC级试剂均用于HPLC分析。其他化学品均为分析级。

植物材料采集

干燥叶片从印度勒克瑙的当地市场购买，并由CSIR-国家植物研究所（NBRI）的专家确认属于CT植物。干燥叶片使用搅拌机研磨成细粉。

结论

尽管C. tamala叶片的乙醇提取物具有显著的抗癌潜力，但目前尚未有研究揭示其对乳腺癌的作用机制。本研究首次报道了CT干燥叶片乙醇提取物（EECTL）的体外细胞毒性、遗传毒性和抗氧化潜力，以及其对人类乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7的作用机制。与其他传统草药类似，...

局限性与未来展望

本研究仅评估了EECTL对MDA-MB-231和MCF-231细胞系的剂量依赖性抑制作用。需要进一步验证EECTL对其他乳腺癌细胞系（如T47D、MDA-MB-468和SK-BR-3）的抑制效果。还需详细探讨EECTL对ATR、CBP/p300、PCAF、p38K、JNK和TP53表达的调控机制。

伦理批准与参与同意

不适用

未引用的参考文献

(Javed等人，2017；Khan等人，2021；Shahwar等人，2015；Srivastava等人，2024；Weaver，2014)

资助

印度医学研究委员会（ICMR）新德里提供了研究资助（编号59/30/2013/online/BMS/TRM）。

CRediT作者贡献声明

Rumana Ahmad：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、验证、项目监督。

Ishrat Husain：数据可视化、方法学研究、数据分析、数据管理。

Chandra Dr. Anu：数据验证、项目监督、资金获取、概念构思。

Srivastava Dr. Mrinal Ranjan：数据验证、项目监督。

Mahdi Dr. Farzana：项目监督、资金获取、概念构思。

利益冲突声明

作者声明以下可能构成利益冲突的财务关系：Rumana Ahmad表示得到了Era医学院与医院的行政支持。其他作者声明没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢印度医学研究委员会（ICMR）新德里提供的研究资助（编号59/30/2013/online/BMS/TRM）。

出版同意

所有作者同意本文的发表。

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。