《Total Environment Microbiology》：The Olive plant microbiome: Regional variations, climate change resilience and Cultivar-Specific Dynamics in Arid and Mediterranean Regions
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本文系统评述了昆虫病原真菌（EPF）如金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）和球孢白僵菌（Beauveria bassiana）作为内生菌在林业树种中的应用潜力。研究通过叶面喷施和土壤施用两种接种方法，评估了其对柚木（Tectona grandis）、水黄皮（Pongamia pinnata）和沙漠柚木（Tecomella undulata）幼苗生长、次生代谢物积累及抗氧化酶活性的影响。结果表明，金龟子绿僵菌表现出更高的定殖率（达85.4%）和促生长效应，显著提升了酚类、单宁含量及过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）等酶活性。相关性分析揭示了抗氧化酶活性与生长参数间呈强正相关（r = 0.72–0.85），证实了增强的氧化还原代谢对植物生长的贡献。该研究为EPF作为多功能生物接种剂在可持续林业管理中的应用提供了科学依据。
内生昆虫病原真菌对干旱区林业树种的促生长机制与生理生化响应
引言
昆虫病原真菌（Entomopathogenic Fungi, EPF），如金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）和球孢白僵菌（Beauveria bassiana），传统上被用作生物防治剂。近年来，其作为无症状内生菌与植物建立互利共生关系的能力日益受到关注。这种双重角色——既是害虫拮抗剂又是植物内生共生体——在作物综合保护和可持续生产方面具有重要意义。尽管在草本作物和受控温室条件下的研究较多，但关于木本多年生物种，尤其是在干旱和半干旱地区用于造林的重要树种的研究仍然有限。本研究旨在评估金龟子绿僵菌和球孢白僵菌作为非病原性内生菌，在促进三种重要树种（柚木、水黄皮和沙漠柚木）幼苗生长、诱导早期生理生化反应以及成功建立内生定殖方面的潜力。
材料与方法
研究从印度农业昆虫资源国家局（ICFRE-AFRI）获取金龟子绿僵菌和球孢白僵菌菌株。真菌在萨布罗葡萄糖琼脂（SDA）或马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）上培养，获得分生孢子悬浮液（浓度调整为1 × 108conidia/mL）。种子表面消毒后播种于灭菌基质中。在幼苗两叶期（发芽后15天），通过叶面喷施和土壤灌根两种方法进行接种，对照组则施用无菌水。接种后的幼苗在网室中培养，定期灌溉。
内生定殖率在接种后两个月进行评估。采集植物组织片段，表面消毒后置于含抗生素的培养基上，计算定殖百分比。植物样品（叶和根）在接种后两个月收集，用于测定生化参数和酶活性。
测定的次生代谢物包括总酚（采用Folin-Ciocalteu法）、单宁（采用香草醛-盐酸法）、铁还原抗氧化能力（FRAP）和总抗氧化活性（采用磷钼法）。测定的抗氧化酶包括过氧化氢酶（CAT，通过监测H2O2在240 nm处吸光度的下降）、抗坏血酸氧化酶（AO，通过监测抗坏血酸在290 nm处吸光度的下降）和抗坏血酸过氧化物酶（APX，通过监测抗坏底物在290 nm处吸光度的下降）。生长参数（根长、茎长、鲜重、干重、地径）在接种后60天和180天测量。所有数据均采用双向方差分析（ANOVA）和LSD检验进行统计分析，并计算了生化参数与生长属性之间的Pearson相关系数。
结果
内生定殖
双向方差分析显示，树种和接种方法均显著影响金龟子绿僵菌和球孢白僵菌的内生定殖，且存在显著的交互作用。对于金龟子绿僵菌，定殖率因树种和接种方法而异，其中柚木的定殖率最高（叶面处理达85.4%），其次是水黄皮（83.6%）和沙漠柚木（82.7%）。土壤接种法的定殖率普遍低于叶面接种法。球孢白僵菌的定殖率总体低于金龟子绿僵菌，但趋势相似，叶面接种同样优于土壤接种。这表明定殖成功率取决于真菌分离物与寄主的相容性以及接种技术。
植物次生代谢物
接种EPF显著提高了所有三种树种叶和根组织中的次生代谢物含量。在柚木中，金龟子绿僵菌处理使叶片酚类含量增加了53.9%，单宁含量增加了41.8%，FRAP活性增加了42.1%，总抗氧化能力增加了34.3%。球孢白僵菌处理也显示出显著的增加，但增幅通常低于金龟子绿僵菌。根部组织也观察到类似的增长趋势。在水黄皮和沙漠柚木中，也观察到了显著的增长模式，金龟子绿僵菌 consistently诱导了更高水平的次生代谢物积累。这些结果表明，真菌内生菌定殖激活了植物的苯丙烷代谢途径。
酶活性
抗氧化酶活性在接种EPF的幼苗中显著增强。在柚木中，金龟子绿僵菌处理使叶片CAT活性增加了53.9%，AO活性增加了83.4%，APX活性增加了95.3%。根部组织的酶活性提升更为显著。球孢白僵菌处理也显著提高了酶活性，但增幅通常小于金龟子绿僵菌。在水黄皮和沙漠柚木中观察到了类似的增强趋势。金龟子绿僵菌在增强氧化应激耐受性和酶促抗氧化潜力方面 consistently表现出优于球孢白僵菌的功效。
幼苗生长响应
接种EPF对三种树种的生长参数均有显著的积极影响。在接种后60天和180天，接种幼苗的根长、茎长、鲜重（根和茎）、干重（根和茎）以及地径均显著高于对照幼苗。金龟子绿僵菌处理的效果通常优于球孢白僵菌处理。例如，在180天时，金龟子绿僵菌处理的柚木幼苗根长达到25.6厘米，而对照组为18.9厘米；茎长达到49.0厘米，而对照组为37.5厘米。叶面喷施法在促进生长方面通常略优于土壤灌根法。树种间的响应也存在差异，表明存在寄主依赖性变异。
生化参数与生长属性之间的相关性
相关性分析揭示了生化参数与生长属性之间存在显著的正相关关系。FRAP活性和APX活性与根长、茎长和生物量参数 consistently显示出强正相关（r值在0.70至0.85之间）。酚类含量也与大多数生长参数呈中度至强正相关。而单宁和总抗氧化活性的相关性则较弱或不显著。这些结果表明，抗氧化酶，特别是APX和FRAP，以及酚类物质，在EPF接种下增强生长性能方面发挥着关键作用。
讨论
本研究的发现与越来越多的证据一致，即昆虫病原真菌可以作为有益的内生菌，促进植物生长并诱导系统抗性。金龟子绿僵菌在定殖效率和促生长效果上优于球孢白僵菌，这可能归因于其更强的组织穿透能力、持久性以及植物生长促进物质（如植物激素和挥发性有机化合物）的产生能力。叶面接种法的优势可能在于其能更直接、快速地进入植物体内部，引发系统性的生理响应。次生代谢物（酚类、单宁）和抗氧化酶（CAT, APX, AO）的显著增加表明，EPF定殖激活了植物的防御和抗氧化系统，从而增强了其对生物和非生物胁迫的耐受性。不同树种对接种响应的差异突出了寄主基因型在决定内生互作成效方面的重要性。强烈的正相关性进一步证实了增强的氧化还原代谢与改善的生长性能之间的功能联系。
结论
本研究证实了金龟子绿僵菌和球孢白僵菌作为内生菌在促进重要林业树种幼苗生长、生理活性和生化韧性方面的潜力。金龟子绿僵菌，特别是通过叶面接种时，表现出作为多功能内生菌的优越性。EPF通过增强抗氧化防御系统和刺激次生代谢，有效提高了植物的活力和对胁迫的恢复力。这些发现为在可持续林业和农林业系统中开发和应用这些环境友好的生物接种剂提供了坚实的科学依据，特别是在干旱和半干旱等环境挑战较大的地区。未来的研究应侧重于田间规模的应用、微生物群落构建以及长期环境适应性，以优化这些有益真菌的实际效用。
