《Toxicology》：NOX4/Keap1/Nrf2/ROS Signaling Drives Ferroptosis in Trimethyltin Chloride-Induced Cardiac Developmental Malformations
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TMT通过激活NOX4/Keap1/Nrf2-ROS轴引发心肌细胞ferroptosis，导致胚胎心脏畸形，抑制该通路或使用ferroptosis抑制剂可缓解损伤，揭示了环境污染物致先天性心脏病的分子机制。
Jin Chen|Hanwen Hu|Jing Fu|Yaolin He|Hui Zhou|Jingwei Lei|Ming Huang|Jianqi Wang|Anfei Liu|Zhenzhong Liu
公共卫生学院，北川医学院，中国四川南充637100
摘要
三甲基锡氯化物（TMT）是一种普遍存在的环境有机锡污染物，已被证实与心脏损伤有关，但其具体机制尚不清楚。TMT暴露会引发过量的活性氧（ROS）生成，而活性氧是铁依赖性脂质过氧化所驱动的凋亡（一种受调控的细胞死亡形式）的关键诱导因素。NADPH氧化酶4（NOX4）在心脏发育过程中高表达，对心肌中ROS的生成起着关键作用，而Keap1/Nrf2通路则调节细胞内的ROS平衡。我们假设TMT通过激活NOX4/Keap1/ROS介导的凋亡来诱导心脏发育缺陷。TMT暴露会导致斑马鱼胚胎出现心脏畸形、心包水肿和心率下降。进一步的研究发现，TMT能够上调胚胎心脏中的nox4表达。值得注意的是，通过药理学抑制或基因敲低nox4可以显著减轻TMT引起的心脏缺陷。此外，抑制nox4还能对抗TMT引发的Keap1/Nrf2轴紊乱、ROS过度积累、线粒体损伤以及与凋亡相关的异常现象，包括Fe2?积累、脂质过氧化加剧和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）表达下降。重要的是，抑制或敲低keap1同样可以减轻TMT引起的ROS爆发、线粒体损伤和凋亡进程。使用特异性凋亡抑制剂（Liproxstatin-1和Myricetin）的干预证实，凋亡直接参与了TMT引起的心脏发育缺陷。本研究表明，TMT通过nox4/Keap1/Nrf2/ROS信号通路激活凋亡从而诱导心脏畸形。这些发现揭示了TMT心脏毒性的新机制，为评估TMT作为先天性心脏病风险因素提供了理论依据，并确定了潜在的分子靶点以用于治疗干预。
引言
先天性心脏病（CHDs）是出生时就存在的心脏结构异常，全球约有每1000名儿童中有11.89人受到影响（Marelli等人，2007年）。环境污染物已成为CHDs的重要致病因素（Sun等人，2022年）。其中，三甲基锡氯化物（TMT）作为一种广泛用于PVC稳定剂、农业杀菌剂和防污涂料添加剂的有机锡化合物，不可避免地会在水、土壤等环境介质以及生物系统中积累（Kim等人，2019年；You等人，2022年）。在职业环境中，暴露于TMT的工人体内的浓度范围为3.75至13.31μM（Wang等人，2008年），而北京关亭和永定河流域的TMT浓度高达360ng/L（Jiemin等人，2003年）。作为一种高毒性物质，TMT可通过吸入、皮肤吸收或摄入进入人体，导致多器官损伤，包括心血管毒性（Liu等人，2021年；Wang等人，2023年）。越来越多的证据表明，TMT暴露会增加心脏疾病的风险；然而，其心脏毒性的分子机制仍不清楚（Cai等人，2022年；Yoneyama等人，2008年）。
先前的研究表明，TMT暴露会引发细胞内活性氧（ROS）的过量生成（Li等人，2023b年）。这种ROS的过度积累会导致氧化应激，并最终激活受调控的细胞死亡途径（Li等人，2023b年；Zhu等人，2023年）。值得注意的是，近年来受到广泛关注的铁依赖性凋亡是一种新的受调控的细胞死亡形式，其关键启动因素之一是ROS的失调（Jiang等人，2021年）。凋亡的特征包括铁（Fe2?）过量、关键抗氧化防御机制（如谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）失活以及致命的脂质过氧化积累（Stockwell等人，2020年）。虽然已知环境毒素可通过凋亡引起心脏损伤，但TMT介导的发育性心脏毒性中凋亡的具体作用尚未明确（Lu等人，2022年；Zhang等人，2024年）。
了解驱动ROS积累和凋亡的上游信号通路对于阐明TMT的毒性机制至关重要（Kasai等人，2020年；Palma等人，2024年）。在细胞内，ROS主要来源于线粒体，线粒体功能障碍会导致ROS过度积累和氧化应激（Keane等人，2015年）。除了线粒体来源外，NADPH氧化酶4（NOX4）也是主要的非线粒体ROS生成酶（Maejima等人，2011年）。在心血管系统中，NADPH氧化酶（NOX）家族是ROS的主要来源，其中NOX2和NOX4亚型在调节心脏ROS水平及导致心血管病理方面起着关键作用（Zhang等人，2020年）。
细胞利用抗氧化防御系统来对抗ROS，其中Keap1/Nrf2通路起着核心调节作用。Keap1（Kelch样ECH相关蛋白1）作为Nrf2（核因子红细胞2相关因子2）的负调节因子和氧化应激传感器（Muthumani和Prabu，2014年；Ulasov等人，2022年）。NOX4表达升高会激活Keap1-Nrf2通路，加剧氧化应激（Yang等人，2020年）。因此，NOX4驱动的ROS生成与Keap1/Nrf2介导的ROS清除之间的动态平衡对于维持心脏的氧化还原平衡至关重要。
基于这些证据，我们假设TMT通过激活NOX4/Keap1/ROS通路来干扰胚胎心脏发育，导致氧化还原失衡和凋亡。本研究利用斑马鱼胚胎作为模型：（1）评估TMT引起的心脏畸形，包括结构缺陷、心包水肿和心率下降；（2）检测NOX4表达、Keap1/Nrf2通路活性、ROS水平、线粒体功能及凋亡标志物（Fe2?、脂质过氧化、GPX4）的变化；（3）使用NOX4抑制剂、keap1敲低剂和凋亡抑制剂（如Liproxstatin-1和Myricetin）验证这一通路的必要性。本研究旨在阐明TMT心脏毒性的新机制，并为预防由环境污染物引起的CHD提供分子靶点。
化学试剂
三甲基锡氯化物（TMT，Aladdin，中国）；虾青素（ASX，TargetMol，美国）；GLX351322（GLX）、Liproxstatin-1（Lip-1）和Myricetin（MYR）购自MedChemExpress（中国）；除非另有说明，所有其他试剂均来自MedChemExpress（中国）。
斑马鱼的饲养和处理
成年AB品系斑马鱼（中国武汉国家斑马鱼资源中心）在循环水养殖系统中饲养（Hunter Biotechnology，中国），温度为28 ± 1°C，光照周期为14小时光照/10小时黑暗，pH值为
Nox4（而非Nox2）在斑马鱼胚胎中介导TMT引起的心脏畸形
首先通过测定斑马鱼胚胎中TMT的72小时半数致死浓度（LC??）来评估其急性毒性，结果约为12.5μM。基于这一发现，选择了一个亚致死浓度范围来进一步研究TMT引起的心脏畸形。斑马鱼心脏主要表达NADPH氧化酶同型nox2和nox4。如图1A所示，TMT显著抑制了斑马鱼胚胎的心脏发育
讨论
TMT是一种普遍存在的环境有机锡污染物，其多器官毒性已被广泛研究。然而，其在胚胎发育过程中的心脏毒性机制仍不明确（Chen等人，2012年；Li等人，2023a年；Liu等人，2020年；Mitrovic等人，2024年）。利用斑马鱼胚胎作为脊椎动物模型，我们证明了TMT通过NOX4/Keap-1/ROS通路诱导的凋亡来引起心脏畸形。我们的数据表明，TMT
结论
本研究证实，TMT通过一个明确的分子级联反应在斑马鱼胚胎中诱导心脏发育畸形。选择性激活NOX4（而非NOX2）会破坏Keap1/Nrf2氧化还原调节通路，引发线粒体ROS的爆发和随后的线粒体膜电位崩溃，最终导致凋亡。这些发现确立了NOX4/Keap1/Nrf2–ROS–凋亡通路是TMT引起心脏毒性的核心机制。
CRediT作者贡献声明
Jing Fu：实验研究。Yaolin He：实验研究。Zhenzhong Liu：项目监督、资金获取。Jin Chen：撰写初稿、实验研究、资金获取。Hanwen Hu：撰写初稿、实验研究。Jingwei Lei：实验研究、数据整理。Ming Huang：资金获取。Jianqi Wang：实验研究。Anfei Liu：项目监督、资金获取。Hui Zhou：实验研究。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了四川省科学技术计划（2020YJ0382，资助人L.Z.）；四川省卫生健康委员会科研项目（19PJ199，资助人L.Z.）；广州市科技规划项目（201804010063，资助人H.M.）；北川医学院博士研究基金项目（CBY23-QDA12，资助人C.J.；CBY23-QDA13，资助人L.A.）；以及大学生创新创业培训计划项目（S202510634081，资助人Z.H.；S202510634063，资助人L.J.；S202510634022，资助人
