《Journal of Oral Microbiology》：Alteration in tongue coating microbiota across different stages of hepatitis B virus-related chronic liver disease
Abstract
Background
乙型肝炎病毒相关慢性肝病（HBV–CLD）患者（包括慢性乙型肝炎CHB、肝硬化LC和肝细胞癌HCC）的舌苔微生物群失调尚未明确界定。
Objectives
本研究旨在揭示HBV–CLD三个不同阶段舌苔微生物群细菌组成的变化。
Design
采用16S rRNA基因测序技术，对16名健康个体和81名HBV–CLD患者（包括25名CHB、27名LC和29名HCC）的舌苔微生物群进行分析。
Results
与健康对照组相比，HBV–CLD患者舌苔细菌丰富度更高（所有P < 0.05）。Beta多样性分析显示HBV–CLD患者与健康对照组之间存在明显的聚类模式（所有p < 0.05）。线性判别分析揭示了健康对照组与HBV–CLD患者之间丰度差异显著的多类 taxa；LC和HCC患者中厚壁菌门（Firmicutes）较高，而CHB患者拟杆菌门（Bacteroidetes）水平较高。对测序数据的PICRUSt2分析揭示了微生物活性随疾病发展而发生的变化。
Conclusions
本研究揭示了HBV–CLD患者舌苔微生物群失调，这可能为疾病监测提供独特的诊断可能性和微生物生物标志物。
Introduction
乙型肝炎病毒（HBV）全球慢性感染人数估计为2.96亿，每年新增近150万病例。慢性乙型肝炎（CHB）患者发生肝硬化（LC）和肝细胞癌（HCC）的风险增加，每年共同导致全球约100万人死亡。"口腔-肠道-肝脏"轴揭示了口腔微生物组、肠道微生物组与肝脏健康之间的联系。口腔微生物群是栖息在口腔的细菌群落，是人体第二大微生物群落。它通常以生物膜的形式出现在口腔硬组织和软组织中。核心人类微生物组普遍存在于所有人群中；其他则是因个人生活方式和身体属性而异的独特微生物谱。这些天然存在的细菌通常无害，并作为屏障阻止致病菌附着于口腔黏膜。只有当细菌越过共生边界时，才会变得具有传染性并导致疾病。口腔是细菌种类最丰富的部位，主要来自放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）和梭杆菌门（Fusobacteria）。这些细菌有些存在于口腔生物膜中，如舌苔和牙菌斑，或者可以自由存在于唾液中。此外，口腔内不同位置的微生物存在明显差异。舌是身体的反映，其生物膜内的微生物在很大程度上是稳定的。舌诊是中医（TCM）的主要诊断技术。舌体的大小、外观、颜色和质地可以提供器官功能和疾病进程的信息。医生越来越多地采用口腔微生物组分析来识别系统性疾病和追踪整体健康。长期HBV感染与免疫系统功能障碍有关，这可能有助于口腔细菌失衡和口腔不适。HBV–CLD患者中某些口腔细菌的富集可作为机会性病原体，并产生可能加剧慢性炎症和延长HBV持续存在的代谢物。肝病患者口腔微生物群的改变反映在肠道微生物组中。根据以往研究的结果，几项研究已经检查了肝脏疾病微生物组成的失调。对HBV–CLD患者的研究主要检查了粪便和十二指肠黏膜中的微生物群。我们假设舌苔微生物群失调与导致CHB、LC和HCC的HBV感染有关。正如早期研究所示，舌苔微生物群与人体其他微生物群落不同。
尚未对健康个体和HBV–CLD患者的舌苔微生物群进行直接比较，HBV–CLD患者舌苔微生物群的特征尚未明确界定。本研究旨在分析HBV–CLD患者与健康对照组舌苔微生物群的差异，以改善患者预后。我们利用16S rRNA测序检查HBV–CLD患者的舌苔微生物群，以阐明其与HBV–CLD临床阶段的关系，旨在识别高危个体的微生物生物标志物，并促进新型无创筛查和诊断方法。
Methods
Subjects' enrolment
参与者于2023年3月至2024年4月期间从兰州大学第二医院招募，旨在调查与HBV–CLD（CHB、LC和HCC）相关的患者的舌苔微生物群，并与在医院进行年度体检时招募的健康个体进行比较。个体慢性HBV感染的验证基于乙型肝炎表面抗原（HBsAg）阳性至少六个月。LC的诊断基于组织病理学结果或超声扫描显示肝脏表皮结节、肝脏实质外观粗糙以及肝内血管轮廓不均匀伴血管狭窄。HCC的诊断采用标准动态影像学检查或病理结果，依据美国肝病研究协会发布的指南。符合以下任何标准的参与者被排除在研究之外：(i) 年龄<35岁或>65岁，且在入组前6个月内使用过抗生素、益生菌和其他免疫抑制药物；(ii) 患有其他肝脏疾病（例如肝内胆汁淤积、丙型肝炎、脂肪性肝炎和非酒精性脂肪肝病）；(iii) 肿瘤超出II期（HCC的TNM临床分期系统）；(iv) 患有牙周炎、龋齿、口腔溃疡和其他口腔疾病；(v) 当前吸烟或大量饮酒（男性>20克/天，女性>10克/天）。
Laboratory measurements
入组时测量基本代谢指标，包括高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、甘油三酯（TG）、血尿素氮（BUN）、血清肌酐（SCr）、空腹血糖（FBS）、血小板计数、总胆固醇（T-CHO）。使用标准试剂盒测量HBeAg、抗-HBe、抗-HBs、抗-HCV和抗-HDV的血清水平。实验室实验在甘肃省兰州市国家卫健委胃肠道肿瘤诊断与治疗重点实验室使用商业标准自动化方法进行。
Tongue coating samples collection and DNA extraction
采样前，指导参与者用无菌水漱口两次，并尽可能伸出舌头。根据Winkel的方法，将舌头分为六个功能区域。由合格的口腔医生使用舌刮匙从舌远端中部区域到前中部区域收集舌苔。涂层样品悬浮在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，移至实验室，振荡并立即离心；弃去上清液。将沉淀物保存在-80°C下以备进一步处理。
使用DNeasy Power Soil试剂盒（德国Qiagen公司）根据制造商指南从舌苔样品中提取细菌DNA。使用琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific公司）测定DNA的浓度和纯度。
16S rRNA gene amplification and sequencing
使用通用引物对（343F: 5′-TACGGRAGGCAGCAG?3′ 和 798R: 5′-AGGGTATCTAATCCT?3′）在25μl反应体系中进行PCR扩增细菌16S rRNA基因的V3-V4高变区。在引物上添加了Illumina测序接头。采用凝胶电泳评估扩增子纯度。使用Agencourt AMPure XP磁珠（美国Beckman Coulter公司）纯化PCR产物，然后使用Qubit dsDNA检测试剂盒进行定量。调整混合文库的浓度，并在Illumina NovaSeq6000上使用250bp双末端读长进行测序。
Bioinformatics and statistical analysis
对原始测序数据使用FASTQ格式进行生物信息学分析。之后，使用cutadapt软件预处理双末端读长，以识别并剪切除去接头。修剪后，使用DADA2默认设置，通过QIIME2（2020.11版）对双末端读长进行低质量序列过滤、去噪、合并和嵌合体读长检测。最后，使用QIIME2程序挑选每个ASV的相应读长。使用q2-feature分类器默认设置，将所有样品读长注释并与Silva数据库（版本138）进行比对。使用QIIME2软件分析Alpha和Beta多样性。评估Alpha多样性参数Chao1指数和Shannon多样性指数以估计样品中的物种丰富度。使用R工具在主坐标分析（PCoA）中基于UniFrac距离矩阵确定Beta多样性。使用Adonis2函数进行999次置换的置换多元方差分析（PERMANOVA），并使用R中的pairwise Adonis包分析Beta多样性的统计显著性。使用R程序通过ANOVA/Kruskal–Wallis/T检验/Wilcoxon统计检验检查组间统计学显著差异。每个测试重复进行，p值小于0.05表示具有经验显著性。使用线性判别分析（LDA）效应量（LEfSe）方法比较分类群丰度范围。使用系统发育调查群落通过重建未观察状态2（PICRUSt2）基于京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库预测微生物群落功能。
Results
Clinical characteristics of subjects
本研究检查了16名健康个体和81名被诊断为CHB、LC和HCC的HBV–CLD患者（分别为25、27和29名）的舌苔微生物群。参与者的基线信息摘要见表1。健康对照组的平均年龄为46岁，CHB患者为49岁，LC患者为57岁，HCC患者为60岁；相应地，男性比例分别为68.75%、60%、59.25%和68.96%。总体而言，与健康对照组相比，CHB、LC和HCC疾病患者的ALT、AST、BUN和肌酐（CRE）水平较高（所有p < 0.05）。与健康个体相比，患者组的血小板计数降低（p < 0.05）。
Overview of the 16S rRNA sequencing data output
16S核糖体RNA（rRNA）基因V3–V4区的扩增子测序产生了7,761,550条读长；每个标本的平均序列读长为80,016条（最小值：78,020；最大值：81,950）。为了考虑样本量相关的变异性，使用稀释法将每个样本的读长标准化为75,925条。稀释后，总共获得4,100个扩增子序列变体（ASVs）。
Differences in tongue coating microbiome structure
图1a强调了HBV–CLD不同阶段共享和独特的ASVs以及已识别ASVs的总数。根据稀释后的ASVs计算Alpha多样性指数。与健康对照组相比，根据Shannon多样性指数计算值，CHB患者的细菌丰富度和均匀度更高（图1c）。Observed species、Chao1和ACE指数显示，LC和HCC患者组的物种丰富度高于健康对照组（图1b, d, e）。PD_whole_tree的预测值显示，与健康对照组相比，LC患者的细菌丰富度更高（图1f）（所有p < 0.05）。
基于加权UniFrac、未加权UniFrac、Bray-Curtis距离和Binary Jaccard的PCoA分析显示健康对照组与三个患者组（CHB、LC和HCC）形成独立的簇（图2a?d）。这些簇因疾病状态的显著影响而区分（所有p < 0.05）。使用PERMANOVA进行两两比较，结果显示三个患者组的舌苔微生物群与健康对照组存在显著差异。
Taxonomic distribution and bacterial abundance
使用每个分类群的相对丰度来描述HBV–CLD中细菌的分布。在舌苔样品中总共发现了10个门、13个纲、29个目、49个科和84个属。图3显示了在各级水平上显著丰富细菌的分类分布。
门水平筛选显示见图S1。六个最丰富的门是拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、梭杆菌门（Fusobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和Patescibacteria；这六个主要分类群共同构成了大部分序列。与健康对照组相比，LC和HCC患者组放线菌门和厚壁菌门的相对丰度显著较高，而CHB患者中拟杆菌门更丰富，所有三个患者组中梭杆菌门的相对丰度较低。
在科水平，梭杆菌科（Fusobacteriaceae）和巴斯德菌科（Pasteurellaceae）在健康对照组的舌苔微生物群中更普遍。链球菌科（Streptococcaceae）和微球菌科（Micrococcaceae）在LC和HCC患者的舌苔微生物群中更丰富。普雷沃菌科（Prevotellaceae）在CHB患者中更丰富（图3a）。
在属水平，在10个判别性属中，罗氏菌属（Rothia）和链球菌属（Streptococcus）的相对丰度在LC和HCC患者组的舌苔微生物群中较高。梭杆菌属（Fusobacterium）和嗜血杆菌属（Haemophilus）在健康对照组的舌苔微生物群中较高（图3b）。HBV–CLD患者舌苔细菌属水平的变化显示在热图S2中。
Differences in tongue coating microbiome composition in HBV–CLD
为了识别每个HBV–CLD组的生物标志物和舌苔微生物群组成的差异，采用了LEfSe方法，使用对数LDA评分来确定HBV–CLD临床阶段之间的主要分类学变化。在健康对照组和HBV–CLD患者之间发现了显著差异（图4a–f）。表S1总结了LEfSe分析中最常见属的LDA评分和p值。
CHB患者与健康对照组之间的比较（图4a）显示，CHB患者中最丰富的属是普雷沃菌属（Prevotella）、别普雷沃菌属（Alloprevotella）和放线菌属（Actinomyces）；而健康对照组中最普遍的属是嗜血杆菌属（Haemophilus）、梭杆菌属（Fusobacterium）和卟啉单胞菌属（Porphyromonas）。
LC患者与健康对照组之间的调查（图4b）显示，LC患者中最富集的属是链球菌属（Streptococcus）和罗氏菌属（Rothia），而健康对照组中最丰富的属是梭杆菌属（Fusobacterium）、嗜血杆菌属（Haemophilus）和卟啉单胞菌属（Porphyromonas）。
HCC患者与健康对照组之间的评估（图4c）显示，HCC患者中最普遍的属是链球菌属（Streptococcus）、放线菌属（Actinomyces）、罗氏菌属（Rothia）和乳杆菌属（Lactobacillus）。相反，嗜血杆菌属（Haemophilus）、梭杆菌属（Fusobacterium）和卟啉单胞菌属（Porphyromonas）在健康对照组中更丰富。
CHB和LC个体之间的可比性（图4d）表明，CHB患者的普雷沃菌属（Prevotella）和别普雷沃菌属（Alloprevotella）种群增加，而LC患者中最富集的属是链球菌属（Streptococcus）和罗氏菌属（Rothia）。
CHB和HCC患者之间的评估（图4e）显示，CHB个体富集了普雷沃菌属（Prevotella）、别普雷沃菌属（Alloprevotella）和嗜血杆菌属（Haemophilus）。相反，链球菌属（Streptococcus）、罗氏菌属（Rothia）和颗粒链菌属（Granulicatella）在HCC患者中更普遍。
最后，对LC和HCC患者进行了调查（图4f）显示，LC患者中奈瑟菌属（Neisseria）和瘤胃球菌属（Ruminococcus）的流行率较高，而HCC患者中最丰富的属是泛菌属（Pantoea）、粪杆菌属（Faecalibaculum）和副萨特氏菌属（Parasutterella）。
Functional analysis of tongue coating microbiota based on 16S rRNA sequencing data
我们使用PICRUSt 2比较了KEGG Level 2通路，以估计舌苔微生物群的功能内容，说明细菌功能随疾病进展的变化。在HBV–CLD患者组和健康对照组之间共发现20个差异丰富的通路（FDR < 0.05）（图5a–f）。HBV–CLD中富集的通路包括聚糖生物合成和代谢、运输和分解代谢、细胞生长和死亡、信号转导、细胞群落-原核生物、癌症概述、细菌传染病、内分泌系统、外源性生物降解和代谢。十个直系同源簇（COG）类别，包括细胞壁生物合成中的糖基转移酶、位点特异性重组酶、外膜受体蛋白、细胞壁合成中的转移酶活性、Na+驱动的多药外排泵、DNA结合转录调节因子、DNA指导的RNA聚合酶、脂蛋白输出系统、假尿苷酸合酶和DNA结合反应调节因子，在三个患者组和健康对照组之间显示出差异（图S3）。
Discussion
HBV–CLD的病因和发病机制复杂。尽管有抗病毒疗法可用，但治愈HBV感染仍然具有挑战性；因此，鼓励研究创新方法，如关注HBV–CLD中的口腔微生物群，可能为该领域提供新的见解。本研究利用16S rRNA测序来表征CHB、LC和HCC患者舌苔微生物群的多样性和组成，并将他们与健康对照组进行比较，以识别微生物失调模式和潜在的微生物生物标志物。
在我们的调查中，三个患者类别的操作分类单元（OTU）数量和观察到的ASVs高于健康对照组。Chao1、observed species、PD_whole_tree和ACE在LC和HCC患者组中升高。与健康对照组相比，CHB患者组的Shannon多样性更高。一项大型中国队列研究发现年龄与微生物Alpha多样性之间没有相关性，这表明三个患者组的不同疾病状态，而不是患者的基线特征，可能导致舌苔微生物群的差异。为了尽量减少混淆，大量饮酒的患者被特别排除在这项关于HBV–CLD患者舌苔微生物群的关键研究之外，因为酒精可以独立改变微生物组成。
PCoA分析（加权/未加权UniFrac、Bray-Curtis、Binary Jaccard）表明HBV–CLD组与健康对照组存在明显的聚类。在Beta多样性方面，HBV–CLD患者和健康个体的微生物组组成在质和量上均存在差异。我们的结果与Zeng等人的结果一致。在另一项调查中，使用基于Bray-Curtis的非度量多维标度进行的Beta多样性分析也显示CHB和LC患者的微生物群组成失调。
在门水平，Patescibacteria、变形菌门（Proteobacteria）和梭杆菌门（Fusobacteriota）在三个患者组中耗竭；相比之下，拟杆菌门（Bacteroidetes）（普雷沃菌属Prevotella和别普雷沃菌属Alloprevotella）的相对丰度在CHB患者中较高，具有最高的LDA评分，其次是厚壁菌门（Firmicutes）（链球菌属Streptococcus、颗粒链菌属Granulicatella和乳杆菌属Lactobacillus）和放线菌门（Actinobacteria）（放线菌属Actinomyces和罗氏菌属Rothia），它们在LC和HCC患者中较高。下一代测序将Patescibacteria鉴定为人类不同栖息地的共生菌，包括口腔、胃肠道和生殖道。病毒性肝炎患者肠道微生物群中的变形菌门减少。梭杆菌门被认为是非致病性共生门。晚期肝病患者的放线菌门水平较高。优势门厚壁菌门和拟杆菌门表现出失调，这与HBV–CLD有关。大多数拟杆菌门是革兰氏阴性菌，可能主要负责执行代谢过程，例如复杂糖聚合物和蛋白质的分解。另一方面，厚壁菌门是革兰氏阳性菌，益生菌有机体和机会性病原体是该门的代表。益生菌是基于微生物群的疗法的例子，可能有助于理解口腔细菌的作用，这有助于创建靶向治疗并通过减少疾病进程来恢复健康的口腔微生物组。口腔卫生和牙科治疗程序，包括口腔预防和洁治，可以有效减少肝病患者口腔中的细菌负荷。这种减少可能减轻病原体易位和全身炎症，潜在地降低疾病进展的风险。
据报道，"口腔-肠道-肝脏"轴介导双向微生物相互作用，这是CLD病理生理学的重要组成部分。它通过唾液或全身循环促进口腔细菌易位到肠道，在那里它们升高LPS水平、细胞因子（TNF-α、IL-6）产生和全身炎症，这可能重塑舌苔微环境。
在我们的研究中，属水平上，卟啉单胞菌属（Porphyromonas）、嗜血杆菌属（Haemophilus）和梭杆菌属（Fusobacterium）在HBV–CLD患者中耗竭。而普雷沃菌属（Prevotella）和别普雷沃菌属（Alloprevotella）在CHB患者中富集。链球菌属（Streptococcus）、乳杆菌属（Lactobacillus）、放线菌属（Actinomyces）和罗氏菌属（Rothia）在LC和HCC患者中富集。消化系统肿瘤和胰头癌患者的舌苔微生物群中嗜血杆菌属（Haemophilus）和卟啉单胞菌属（Porphyromonas）水平较低。梭杆菌属（Fusobacterium spp.）被描述为人类口腔微生物群中的共生生物。颗粒链菌属（Granulicatella）在口腔癌患者中更普遍。系统发育分析显示，放线菌属（Actinomyces）和链球菌属（Streptococcus）是CHB相关CLD唾液中的优势属。乳杆菌属（Lactobacillus spp.）被广泛用作益生菌，可有效改善胃肠道感染、腹泻、炎症性肠病、非酒精性脂肪肝病、脂肪性肝炎和消化系统疾病。链球菌属（Streptococcus）和罗氏菌属（Rothia）可能作为机会性细菌发挥作用，增加炎症和系统性疾病中的口腔微生物组多样性。这个过程可能与HBV–CLD相关。值得注意的是，一部分链球菌属（Streptococcus）从CHB到HCC状态持续积累。在HBV DNA病毒载量低的CHB患者中发现别普雷沃菌属（Alloprevotella spp.）富集。普雷沃菌属（Prevotella）在CHB患者的肠道微生物群中更丰富。LEfSe建模和LDA评分显示，CHB、LC和HCC组包含可以区分健康个体和HBV–CLD患者的舌苔微生物分类群。舌苔微生物群失调的独特模式表明，舌苔细菌可以作为HBV–CLD患者无创早期检测的工具。
PICRUSt2分析应用于16S rRNA测序数据，推断HBV–CLD舌苔微生物群的功能潜力，识别代谢通路，通过将微生物分类群连接到KEGG参考数据库来帮助阐明疾病机制，表明微生物在持续病毒感染和慢性炎症中的作用。我们确定了在
