《Mycobiology》：Diversity and Community Structure of Endophytic Fungi Isolated from the Brown Macroalga Sargassum thunbergii in Coastal Regions of Jeju Island, Korea
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本文系统研究了济州岛五个海岸点鼠尾藻（Sargassum thunbergii）内生真菌的多样性与群落结构，并通过α多样性（Shannon指数、Chao1丰富度）、β多样性（PCoA、PERMANOVA）及冗余分析（RDA）揭示了月均水温（WT-M）和溶解氧（DO）是驱动群落差异的关键环境因子，为理解藻-菌互作及海岸环境变化提供了重要基线。
摘要
本研究采用培养法对济州岛五个海岸点（古山、??、龙潭、金陵、瓮坪）的鼠尾藻（Sargassum thunbergii）内生真菌多样性及群落结构进行了表征，并探讨了其与海洋环境因子之间的关系。共获得235株分离株，归属于54属94种，其中子囊菌门（Ascomycota）占分离总数的97.9%。群落组成在不同站点间差异显著，Didymella和Neocosmospora等属为优势类群。α多样性在西部站点（古山、??）较高，而在东北部站点（金陵、瓮坪）较低；β多样性分析也显示出站点间群落的明显分离。排序分析和约束分析表明，月均水温（WT-M）和溶解氧（DO）是与群落变异最密切相关的环境因子。值得注意的是，Neocosmospora solani在所有站点均有出现，而多数物种仅局限于单一地点。这些发现支持了济州岛沿岸水域的理化特性可能导致S. thunbergii内生真菌群落存在区域差异的观点。本研究为理解济州岛周边藻-菌相互作用提供了基线，并凸显了内生真菌多样性作为海岸环境变化敏感指标的潜力。
1. 引言
内生真菌是一类在宿主组织内部定殖而不引起明显病害症状的微生物，广泛分布于陆地和水生生态系统。其定义已扩展至包括大型海藻在内的多种光合作用宿主。在藻类宿主中，内生真菌通常以子囊菌门（Ascomycota）为主，且常见于陆地植物的属（如Aspergillus、Penicillium、Fusarium、Chaetomium、Alternaria和Cladosporium）也频繁出现。
内生真菌作为宿主与环境界面上的化学介质，通过增强宿主对病原体、植食、紫外线辐射和盐度波动的防御能力，在宿主的胁迫耐受和群落稳定性中发挥作用。这些功能很大程度上由其产生的次级代谢产物所支撑，这些代谢物具有抗菌、抗真菌、抗氧化、抗炎和抗癌活性，在医药、水产养殖、农业和环境生物技术领域展现出应用潜力。与陆地系统相比，高盐、温度多变和水压等海洋环境条件驱动了独特的生物合成途径和基因簇表达，从而产生了新颖的化学骨架。因此，海藻相关内生真菌可作为陆地研究的补充比较系统，并是未开发生物多样性和生物活性的重要来源。
鼠尾藻（Sargassum thunbergii）是一种多年生褐藻，在西北太平洋潮间带形成广泛的藻床。其茂密的种群为多种海洋动物提供了栖息地、避难所和育苗场，并在海岸生物地球化学循环和生态系统稳定性中扮演重要角色。由于其高生产力以及对高温、强辐射和干燥的耐受性，鼠尾藻是东北亚海岸的关键物种，并被提议作为海藻林恢复和水产养殖发展的候选物种。这些生态作用依赖于其与外生和内生微生物群的密切关联，使得鼠尾藻成为研究藻类内生真菌多样性和群落结构的合适模型。
尽管全球藻栖真菌研究进展迅速，加速了新分类群和生物活性代谢物的发现，但韩国大型海藻相关真菌的研究仍然有限。先前对鼠尾藻内生真菌的研究主要集中在朝鲜半岛的东、西和南海岸。虽然已有从济州岛采集的Sargassum物种中分离出若干新记录或先前未报道的分类群，但针对济州岛海岸多点、群落水平的内生真菌综合分析仍较缺乏。
济州岛受对马暖流影响，在温度、盐度和溶解氧等方面存在明显的梯度，代表了与大陆海岸不同的独特海洋环境。这种条件可能导致即使在同一宿主（鼠尾藻）内，内生真菌群落也存在显著的站点效应和区域尺度差异。因此，建立济州岛鼠尾藻内生真菌的基础信息，比较不同区域间的群落结构，并分析与环境因子的关联，具有重要的学术和应用价值。
据此，本研究旨在分离和鉴定济州岛周边鼠尾藻的内生真菌，以（i）量化其多样性，（ii）比较区域间的群落结构，以及（iii）探索可能解释所观察到的群落格局的环境因子。
2. 材料与方法
2.1. 样品采集与制备
于2025年4月，从韩国济州岛五个海岸区域的潮间带采集了健康的鼠尾藻藻体。每个站点随机选择生长在潮间带岩石上的五个不同鼠尾藻种群进行采样，确保种群间至少间隔10米以避免伪重复。采集的海藻立即放入装有环境海水的洁净塑料容器中，并在12小时内于阴凉条件下运回实验室进一步处理。
2.2. 表面消毒与内生真菌分离
为去除潜在的表面污染物，藻体首先用自来水彻底冲洗，然后切成约1.5 × 0.5 cm的小片段。每个片段依次用70%乙醇浸泡15秒进行表面消毒，随后用无菌海水冲洗以去除残留乙醇。消毒后的组织用无菌棉轻轻吸干，然后置于两种不同的培养基上：用天然海水制备的Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol琼脂（DRBC）和添加了氯霉素的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）。所有接种的培养皿在25°C黑暗条件下培养，并将长出的菌丝转移到新鲜的PDA平板上以获得纯真菌分离株。
2.3. 分离真菌菌株的分子鉴定
使用HiGene基因组DNA提取试剂盒从纯内生真菌菌株的菌丝中提取基因组DNA。使用引物对ITS1F和ITS4通过聚合酶链式反应（PCR）扩增核糖体DNA的内转录间隔区（ITS）。PCR扩增条件为：95°C初始变性2分钟，随后进行35个循环（95°C 20秒，50°C 40秒，72°C 1分钟），最后72°C延伸5分钟。PCR产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳验证片段完整性和预期大小。纯化的扩增子送至Macrogen公司进行测序。将获得的序列与NCBI核苷酸数据库进行BLAST比对。序列相似性≥99%的真菌分离株鉴定到种水平，相似性较低的则鉴定到属水平。
2.4. 环境数据获取
海水温度数据来自韩国国立水产科学院（NIFS）的实时海洋观测系统。计算了年、季、月、周四个时间尺度的平均值，分别记为WT-A、WT-S、WT-M和WT-W。盐度（PSU）、pH和溶解氧（DO）数据来自韩国海洋环境管理公团（KOEM）的海洋环境监测网络。对这些变量计算季度平均值并用于分析。
2.5. 真菌多样性与群落结构的统计分析
所有统计分析使用R软件进行。使用Shannon指数和Chao1丰富度计算α多样性，并使用Kruskal-Wallis检验评估站点间差异。基于Bray-Curtis相异性的主坐标分析（PCoA）可视化β多样性，并使用PERMANOVA检验站点间组成差异。使用基于Hellinger转换数据的冗余分析（RDA）评估环境关联；对七个环境变量应用基于调整R2停止准则的前向选择，并通过置换ANOVA评估模型和轴的显著性。
3. 结果
3.1. 分离的内生真菌组成与分类概述
从济州岛五个海岸点的鼠尾藻中共分离到235株内生真菌菌株。ITS序列分析鉴定出54属94个明确物种。物种丰富度在各站点间差异显著。在物种水平上，Didymella ellipsoidea和Didymella sp. 1在古山占优势，N. solani和Cladosporium cladosporioides在??占优势，Cladosporium halotolerans在龙潭占优势，而N. solani在金陵和瓮坪均占优势。仅有N. solani一个物种在所有五个站点均被检测到，而大多数物种仅局限于单一站点。在属水平上，Didymella在古山占优势，Talaromyces和Penicillium在??占优势，Cladosporium在龙潭占优势，Neocosmospora在金陵和瓮坪占优势。在科、目、纲水平上，优势类群也呈现明显的站点差异。总体而言，235株分离株中的230株（97.9%）属于子囊菌门（Ascomycota），而2株担子菌门（Basidiomycota）菌株仅从??分离，3株毛霉门（Mucoromycota）菌株仅从古山分离。这些结果表明，鼠尾藻的内生真菌群落主要由子囊菌门组成，并且从物种到更高分类水平上均存在明显的站点间优势类群差异。
3.2. 各站点的α多样性
与鼠尾藻相关的内生真菌群落的α多样性在济州岛五个采样点间存在显著差异。Shannon多样性指数显示站点间存在显著差异，??和古山的多样性最高，其次是龙潭、瓮坪和金陵。事后Dunn检验表明，金陵的Shannon多样性显著低于??和古山。Chao1丰富度估计值在各站点间也存在显著差异，??和古山的丰富度最高，其次是龙潭、瓮坪和金陵。Dunn多重比较表明，金陵的丰富度显著低于古山、??和龙潭。这些结果表明，鼠尾藻的真菌多样性和丰富度在西部海岸站点（古山、??）最高，而在东北部海岸（金陵、瓮坪）显著降低。
3.3. β多样性与环境相关性
基于Bray-Curtis相异性的主坐标分析（PCoA）揭示了五个海岸点群落组成的明显差异。PERMANOVA确认站点对β多样性有显著影响。在排序空间中，位于西海岸的古山与其他所有站点明显分离，表明其具有独特的真菌组合。北海岸的??和龙潭形成一个密切相关的集群，而东海岸的金陵和瓮坪聚集在一起，显示出组成相似性。这些模式表明群落结构存在西向东的梯度，古山独特，??-龙潭组成相似群，金陵-瓮坪显示另一连贯组合。
基于Hellinger转换数据的冗余分析（RDA）解释了总群落方差的18.7%。整体模型显著，且两个典型轴均捕获了显著结构。前向选择保留了WT-M（月均水温）和DO（溶解氧）作为唯一的显著预测因子。RDA1主要反映了WT-M梯度，而RDA2与DO相关，表明内生真菌群落的组成与这些环境因子显著相关。
在最初考虑的七个环境变量中，检测到强烈的共线性，特别是温度相关参数之间以及PSU和pH之间。经过标准化和基于调整R2停止准则的前向选择后，仅WT-M和DO作为独立且显著的预测因子保留。这两个变量独特地解释了群落组成的变化，形成了一个简约且统计稳健的模型。
4. 讨论
本研究提供了济州岛五个海岸点鼠尾藻内生真菌群落的比较视图。α多样性在站点间变化显著，西部站点丰富度和多样性较高，东部站点值较低。群落相异性分析进一步表明组成存在显著的站点间差异，而冗余分析确定月均水温和溶解氧是群落变异的主要环境相关性因素。这些发现与海岸海洋环境特征在塑造群落结构中的作用一致。
这些模式与海藻相关内生真菌的调查结果大体一致，同样报告了子囊菌门的绝对优势以及常见于陆地宿主的属的频繁出现。此类研究还表明，内生真菌多样性和群落结构受多种驱动因素影响，包括局部理化条件、宿主衍生的抗真菌化合物以及可能破坏藻-菌共生并重构群落的更广泛的非生物胁迫。与先前对韩国东、西和南海岸鼠尾藻的研究一致，我们的济州岛数据集恢复了相同的核心属；然而，济州岛有两个显著特征：Neocosmospora和Didymella的出现频率相对较高，以及清晰的站点间群落划分。
西部站点（古山、??）观察到较高的物种多样性，而东部站点（金陵、瓮坪）多样性较低。根据高分辨率海洋环流模型得出的平均海流数据，济州岛西海岸和北海岸直接受对马暖流影响，导致水体运动活跃，而东海岸相对停滞。这种有限的水流可能限制真菌繁殖体和菌丝碎片的扩散，导致群落结构简化。此外，东部站点通常表现出较低的海水温度，这可能进一步促进了在这些环境限制下观察到的内生群落组成差异。
与这些模式一致，RDA结果显示，来自金陵和瓮坪的真菌群落与环境梯度的低温端相关。这一发现强化了藻类内生真菌群落可以对周围海洋环境中的理化变化敏感响应的观点。它还证明了在同一宿主物种内存在明显的站点效应，表明鼠尾藻相关内生真菌群落强烈地受到局部生境条件的结构化。值得注意的是，沿韩国东、西和南海岸的鼠尾藻内生真菌区域比较同样报告了站点间群落差异，海水温度成为群落结构的关键相关性因素。
需要指出的是，仅基于ITS的种水平鉴定需谨慎解读，特别是对于Didymella、Cladosporium、Neocosmospora和Talaromyces等属，建议使用多位点数据。本研究主要关注站点间的群落水平模式。未来结合额外基因位点和非培养方法（如宏条形码）的工作对于解析物种边界和验证本文报告的模式至关重要。
本研究首次全面比较了济州岛海岸鼠尾藻内生真菌多样性和群落结构的区域模式。通过定量识别海洋环境因子与真菌群落组成之间的相关性，我们的研究结果为理解藻-菌相互作用提供了有价值的基线，并凸显了内生真菌多样性作为海岸生态系统环境变化敏感指标的潜力。
