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本文通过多基因位点（ITS、LSU、rpb2、gapdh）系统发育分析，重新鉴定了日本大麦和小麦病原核腔菌属（Pyrenophora）物种，发现原先归类为Py. tritici-repentis的日本分离株实为Py. trichostoma，且携带特有毒素基因ToxA24单倍型，揭示了日本核腔菌物种多样性被长期低估，为作物病害精准防控提供了关键分类学依据。
Abstract
禾本科植物病原真菌核腔菌属（Pyrenophora）对全球大麦和小麦生产构成重大威胁。在日本，Pyrenophora tritici-repentis长期被认为是小麦黄斑病的致病菌，但初步分子数据提示可能存在其他核腔菌物种。为明确日本禾本科植物上核腔菌的物种多样性及系统发育关系，研究分析了来自大麦和小麦病叶的13个分离株及37个菌种保藏库分离株，基于ITS、LSU、rpb2和gapdh基因串联数据集进行系统发育分析。结果显示，所有曾被标记为Py. tritici-repentis的日本分离株实为Py. trichostoma，且这些菌株均携带产毒基因ToxA。此外，部分日本菌株的标签需修正。结果表明日本核腔菌物种多样性较既往报道更高，修订核腔菌属分类学十分必要。
1. 引言
核腔菌属作为子囊菌门真菌，可侵染冰草属、剪股颖属、燕麦属、雀麦属、鸭茅属、羊茅属、大麦属、黑麦草属、早熟禾属及小麦属等多种禾本科植物，其无性态通常为德氏霉属（Drechslera）。基于ITS、LSU、gapdh、tef、tub2和rpb2等多基因序列的系統发育分析表明，该属的单系性与形态学物种界定一致。然而，仅依靠在寄主植物或培养物上观察到的形态特征进行无性态物种界定十分复杂，因许多物种形态特征重叠，类似 bipolaris 和 curvularia 属的情况。
大麦（Hordeum vulgare L.）和小麦（Triticum aestivum L.）是受核腔菌影响的主要谷类作物。其中，Pyrenophora tritici-repentis 引起大麦和小麦的黄斑病或褐斑病，是全球范围内导致严重减产的重要病原菌。在日本，该菌曾报道于冰草属、披碱草属和小麦上。近年来，为提高生产效率，小麦种植制度如轮作、水田改旱田等变化，引发了新兴和再发病害，但基于现代分类标准的鉴定和诊断信息缺乏。2024年，在日本三重县一块由稻田改造的麦田中观察到由核腔菌引起的小麦黄斑病。初步形态鉴定将具有褐色横隔孢子的无性态归为核腔菌属，根据历史记录推测病原菌为Py. tritici-repentis。然而，多位点分析表明实际物种是Py. trichostoma。为确认病原菌，研究分析了田间分离株和日本菌种保藏库的核腔菌属菌株，通过多位点系统发育分析重新审视其分类地位。
2. 材料与方法
从日本三重县具有黄斑或坏死斑症状的大麦和小麦叶片上共分离到13个真菌菌株，标本保藏于三重大学大学院生物资源学研究科植物标本室（TSU-MUMH）。采用微圆柱法获得单孢分离株，菌株保藏于三重大学植物病理学研究室（TSU-MUCC）。另从日本菌种保藏库（MAFF、NBRC）获取9个核腔菌参考菌株用于系统发育分析。
使用Kaneka Easy DNA Extraction Kit version 2从PDA培养基上的菌丝体提取基因组DNA。PCR扩增4个基因位点：28S nrRNA基因（LSU）、rDNA内转录间隔区（ITS）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（gapdh）、RNA聚合酶II第二亚基（rpb2）以及毒素基因ToxA。PCR反应体系包含1–10 ng基因组DNA、10× NH4反应缓冲液、2.5 mM MgCl2、40 μM dNTP、各0.16 μM引物、0.5 U Taq DNA聚合酶，总体积12.5 μL。PCR循环条件为：94°C预变性3分钟；35个循环（94°C变性30秒，位点特异性退火温度30秒，72°C延伸45秒）；72°C终延伸5分钟。rpb2扩增采用降落PCR程序。扩增产物纯化后，使用BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit version 3.1进行双向测序。序列经MEGA v.7软件拼接，与GenBank中核腔菌属序列比对形成串联矩阵。DNA序列矩阵保存于Figshare，新序列提交至GenBank。
采用最大似然法（ML）估计系统发育关系，使用RAxML-NG软件进行分析，替代模型由ModelTest-NG基于AIC值选择。各分区进化模型为：LSU（JTN93+I+G4, 1–826 bp）、ITS（TIM2+I+G4, 827–1324 bp）、gapdh（TN93+I+G4, 1325–1987 bp）、rpb2（TIM3+I+G4, 1988–2702 bp）。采用bootstrap分析评估分支支持率。基于TCS方法构建9个日本新分离株和36个已报道菌株的ToxA编码基因单倍型网络。
3. 结果
3.1. 日本小麦标本症状及形态特征
叶斑呈暗褐色带黄色晕圈，散生，大小2–3 mm，后期扩大融合，中心变为褐色，外围具宽黄色区，最终覆盖全叶。在麦芽提取物琼脂（MEA）上菌落棉絮状，气生菌丝丰富，边缘整齐，颜色呈灰色至橄榄灰色或草黄色。分生孢子梗从气孔伸出，单生，浅褐至褐色，直或膝状弯曲；分生孢子圆柱形至倒棍棒形，透明至浅橄榄褐色，壁光滑至微糙，具假隔膜，大小（72.5–）75–172.5（–182.5）×（7.5–）10–12.5（–17.5）μm。部分菌株在灭菌麦秆上形成具刚毛的不育子囊果。
3.2. 系统发育
基于LSU、ITS、gapdh和rpb2串联矩阵（总长2702 bp）构建ML树，包含98个操作分类单元（OTUs）。日本核腔菌分离株分布于15个高支持率的支系，分别对应Py. avenicola、Py. biseptata、Py. bromi、Py. catenaria、Py. chaetomioides、Py. dictyoides、Py. erythrospila、Py. grahamii、Py. nisikadoi、Py. lolii、Py. nobleae、Py. poae、Py. teres和Py. trichostoma。另有2个分离株为未知核腔菌物种。
多个保藏菌株标签需修正：MAFF 511319（原标Py. dematioidea）实为Py. biseptata；MAFF 305434（原标Py. aveniae）实为Py. chaetomioides；MAFF 305411（原标Py. graminea）和NBRC 6640（原标Drechslera tritici-vulgaris）实为Py. teres。尤为重要的是，所有原鉴定为Py. tritici-repentis的保藏菌株（如MUCC3937=MAFF 150079等）均被重新鉴定为Py. trichostoma。
ToxA基因序列（587 bp，编码196个氨基酸）单倍型网络分析显示，45个序列中存在19个核苷酸和19个氨基酸单倍型。除一株Py. trichostoma（MUCC3937）在氨基酸位点114存在天冬氨酸（D）多态性外，其他Py. trichostoma分离株及一株系统发育远缘的Pyrenophora sp.（MUCC3905）均携带与日本Py. tritici-repentis新单倍型（PtrH2=ToxA24）一致的序列，提示该单倍型可能是日本核腔菌的特征性标记。
4. 讨论
系统发育分析表明，部分日本核腔菌分离株的分类标签需修订。以往对禾本科植物上核腔菌和德氏霉属物种的鉴定多依赖寄主植物和难以区分的形态特征，尤其是Py. tritici-repentis和Py. trichostoma的分类地位长期混淆。Py. tritici-repentis及其无性态Drechslera tritici-repentis曾被认为具有最广的寄主范围，在日本被广泛接受为小麦黄斑病病原。Shoemaker曾将D. tritici-repentis和D. tritici-vulgaris视为不同种，但后期研究将后者归为前者的异名。
Hosford曾将小麦叶枯病病原处理为Py. trichostoma（常被报为H. tritici-repentis）。近期分子系统发育研究证实Py. trichostoma构成独立支系，与Py. tritici-repentis明显不同。本研究中，所有日本分离株均被鉴定为Py. trichostoma，未发现Py. tritici-repentis，即便较早（1960年代）的菌株亦如此。此外，既往研究中标注为Py. tritici-repentis的ITS序列与日本Py. trichostoma高度相似，而韩国近期报道基于系统发育关系确认了小麦上Py. tritici-repentis的存在。
日本Py. tritici-repentis分离株的ToxA基因为新单倍型ToxA24（PtrH2）。对本研究及Hafez等曾报道的菌株重新分类后，确认它们均属Py. trichostoma。除一株例外，所有受试菌株均携带ToxA24单倍型，且系统发育远缘的支系也共享该单倍型，提示其可能通过水平基因转移成为日本核腔菌的特征。
鉴于真菌毒素变异及寄主反应可能导致的症状和致病性差异，持续修订重要作物病原核腔菌属的分类至关重要。本研究揭示了日本核腔菌物种多样性，强调需在全球范围内重新评估小麦和大麦上的核腔菌物种如Py. tritici-repentis和Py. trichostoma的界定。
