《Mycobiology》：Soil Chemistry and Microbial Community Patterns Across Tricholoma matsutake Fairy-Ring Developmental Stages in Yeongju, South Korea
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本研究揭示了松茸（Tricholoma matsutake）菌塘（shiro）发育过程中，交换性钾（K+）和水溶性铁（Fe）分别主导真菌与细菌群落重构的核心机制。通过多季节采样与宏条形码（metabarcoding）分析，发现菌塘空间异质性（而非季节性）是微生物群落构建的主导因素，为理解外生菌根（ECM）真菌驱动的生物-非生物互作提供了新视角。
Abstract
本研究调查了韩国荣州赤松林中松茸（Tricholoma matsutake）菌塘（shiro）发育阶段、土壤理化性质及季节变化如何影响其相关真菌和细菌群落。通过对过去、现在和未来菌塘区域的季节性土壤样本进行ITS和16S rRNA宏条形码分析及土壤化学测量，发现菌塘驱动的空间异质性（而非季节性）是构建微生物群落的主导因素。真菌群落在不同菌塘阶段差异显著，其中交换性钾（K+）是主要驱动因子，并能强预测松茸丰度。活跃菌塘区K+升高伴随真菌多样性降低，暗示优势外生菌根类群的竞争排斥。相反，细菌群落主要受水溶性铁（Fe）影响，从过去区以酸杆菌门（Acidobacteria）为主转变为活跃区以变形菌门（Proteobacteria）为主。铁载体相关类群的富集提示铁获取过程的潜在作用，与菌根辅助细菌（MHB）假说机制大体一致（虽未直接验证）。总体而言，松茸发育产生营养特异性生物地球化学梯度——钾对真菌、铁对细菌——从而重组土壤微生物群落。这些发现强调了菌塘生态中紧密的生物-非生物互作，并指出微生物和化学特征可作为菌塘活动的指示指标。
1. 引言
外生菌根（ECM）真菌是森林生态系统功能的核心：它们增强宿主对水分和矿质营养的吸收，并介导跨尺度的碳-氮-磷耦合循环及地下生物地球化学过程。其中，松茸是温带东亚针叶林林中具有重要文化和经济价值的物种。松茸形成密集的菌丝聚合体（菌塘），其在视觉和理化特性上与周围土壤截然不同，通常位于约5–20厘米深的矿质层，且常与砂质质地、低pH和低持水量相关。这些独特的土壤条件暗示其对共存土壤生物及松茸生产力本身存在强烈的生境过滤作用。
基于扩增子的下一代测序（NGS）揭示了菌塘土壤的一致模式：与邻近非菌塘土壤相比，真菌α多样性降低，群落组成简化，松茸优势在景观尺度上塑造了真菌组。虽然真菌优势已被充分记录，但菌塘也蕴藏着独特的细菌组合，这些细菌可能影响或响应真菌活动。先前研究表明，酸杆菌门、变形菌门和放线菌门常主导松茸相关土壤，这些类群的变化反映了养分可用性、氧化还原条件和金属动态。其中一些细菌可能作为菌根辅助细菌（MHB），通过动员顽固养分或产生铁载体用于铁获取来支持真菌生长。然而，与真菌动态相比，细菌群落演替与土壤化学梯度之间的具体联系研究较少，且整合真菌-细菌视角的研究仍然有限。同时，跨产区比较工作表明，土壤化学随地点和发育阶段而变化，例如酸性pH（约3.95至6.56）以及碱基阳离子和微量金属（如Fe、Mn、Zn和Cu）的异质性是松茸栖息地的常见特征，并且已注意到K、Mn和Ca的区域特异性差异。这些研究共同指出了菌塘发育与土壤理化性质之间的相互作用。
然而，大多数野外设计仍是快照式，通常局限于收获季节，限制了关于季节性及其与菌塘进展和土壤化学相互作用的推断。因此，我们仍然缺乏在同一样本上联合评估（i）菌塘发育阶段、（ii）季节和（iii）土壤理化性质，并将这些与NGS衍生的群落指标和松茸相对丰度相关联的综合评估。
本研究通过系统采样菌塘不同阶段（覆盖过去、现在和未来区域）和季节来填补这一空白。我们量化了土壤化学（pH、有机质、有效氮磷、交换性阳离子及相关土壤变量），并分别使用ITS和16S rRNA基因宏条形码表征了真菌和细菌群落。我们检验三个广泛预期：（i）菌塘发育阶段将解释土壤微生物群落的显著变异；（ii）土壤理化性质，特别是特定的营养梯度如K和Fe，将与真菌和细菌组合的转变有不同的相关性；（iii）季节效应（如果存在）将与区域水平差异相比处于次要地位。
2. 材料与方法
2.1. 研究地点与土壤采样
土壤采样在韩国荣州一个以赤松为主的松茸生产林中进行。为考察季节变化，土壤采样在四个时间点进行：春季（4月）、夏季（6月）、秋季（9月）和冬季（12月）。菌塘发育区域根据特征性灰白色菌丝聚集体的视觉存在分为过去、现在和未来区域。过去区指菌塘活动已减弱的区域，通常显示微弱或退化的菌丝痕迹；现在区对应于活跃菌丝前沿，密集白色菌丝集中处；未来区指示向外扩展的边缘，菌丝开始延伸但尚未形成清晰可见的连续菌塘。对照土壤在菌塘边界外3–6米、缺乏可见菌丝形成的区域采集。清除凋落层后，使用灭菌工具在约10厘米深度采集土壤。所有土壤样本转入无菌聚乙烯袋，彻底均质，冰上运输。用于理化分析的子样本保持冷藏，而用于DNA提取的土壤在-20°C保存。为捕捉区域内变异性，每个季节每个菌塘区域采集三个重复土芯，在区域内均质并混合，生成每个区域-季节组合的一个复合样本。本研究共分析了23个真菌（ITS）样本和33个细菌（16S）样本。
用于化学分析的土壤样本经风干过筛（2毫米网孔）后进行详细分析。测定土壤pH并量化关键营养浓度，包括总氮（Total N）、总磷（Total P）和无机氮形态（NH4+–N和NO3?–N）。此外，测量土壤有机质和有效铁（Fe）水平以评估菌塘区域的特定微环境条件。
2.2. DNA提取与文库构建
使用DNeasy PowerSoil Kit从0.5至1克均质土壤中提取基因组DNA。DNA浓度和纯度使用VICTOR Nivo?系统通过PicoGreen测定法定量。扩增子文库根据Illumina指南制备。细菌群落使用引物341F和805R扩增V3-V4区域；真菌群落使用引物ITS3和ITS4扩增ITS区域。PCR反应使用Herculase II Fusion DNA Polymerase进行。热循环条件如下：95°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸30秒，共25个循环，最后72°C延伸5分钟。PCR产物使用AMPure XP磁珠纯化。随后，使用10微升纯化产物作为第二次PCR（10个循环）的模板，使用Nextera XT索引引物附加双索引和测序接头。最终文库经纯化、定量，片段大小分布在TapeStation D1000 ScreenTape系统上确认。文库经归一化、混合、qPCR定量，在Illumina MiSeq平台上测序。
2.3. 生物信息学处理与统计分析
为校正样本间测序深度差异，数据集通过稀释进行标准化。基于观察到的最小测序深度确定最佳稀释深度，以保留所有样本进行下游分析。因此，ITS和16S rRNA基因数据集分别稀释至每样本19,768和13,402条读数。观察特征的α稀释曲线证实该深度足以捕获代表性微生物多样性。质量过滤的双端读数在QIIME2中使用DADA2流程进行去噪、去重复、嵌合体去除和扩增子序列变异（ASV）推断。真菌（ITS2）和细菌（16S rRNA）ASV的分类学鉴定使用BLAST+针对UNITE和SILVA参考数据库进行。在QIIME2中计算α多样性指数和稀释曲线。使用Bray-Curtis相异度评估β多样性，并通过主坐标分析（PCoA）可视化。在R中进行进一步统计分析。使用PERMANOVA检验菌塘发育阶段和季节对群落组成的差异。使用SIMPER分析识别导致组间相异性的细菌类群。对于土壤理化变量、松茸丰度和优势细菌类群之间的相关性分析，使用中心对数比（CLR）转换的相对丰度以减少组成偏差。对于单变量比较，在分析前检验数据正态性和同质性。参数比较使用经Benjamini-Hochberg（BH）校正的成对t检验，而非参数数据使用Kruskal-Wallis检验后进行Dunn事后检验。使用Spearman等级相关和线性回归评估土壤化学与真菌或细菌丰度模式之间的关系。统计显著性设定为p < 0.05。
3. 结果
3.1. 菌塘发育区域的土壤化学性质
土壤化学在松茸菌丝的三个发育区域间显示出明显变异。水溶性铁（Fe）、有效磷（P）和电导率（EC）的浓度在菌塘（现在）区显著高于内部（过去）区。虽然交换性钾（K+）在菌塘（现在）区呈增加趋势，但由松茸活动驱动的最显著改变出现在Fe、P和EC梯度上。相比之下，有机质、总氮和pH在区域或季节间无显著差异。
3.2. 真菌群落组成与多样性
真菌群落组成在不同菌丝环区域显示出清晰的差异模式。基于Bray-Curtis相异度的PCoA显示样本分为两大组：松茸优势（相对丰度 > 40%；过去和现在区）样本组与松茸缺失或较少优势（未来区和对照）样本组。PERMANOVA结果证实真菌群落组成在三个菌塘区域间差异显著，但无显著季节效应。当将土壤变量拟合到排序中时，交换性钾是唯一显著解释真菌群落模式的因子。
SIMPER分析显示，松茸是导致过去区与现在区群落相异性的主要贡献者，其在现在区相对丰度显著更高。相比之下，包括瓶头霉属（Phialocephala）sp.、革菌科（Thelephoraceae）sp.和真菌（Fungi）sp.在内的几个属类群在过去区丰度更高。伞霉属（Umbelopsis）sp.和柔膜菌目（Helotiales）sp.等额外贡献者也显示区域特异性富集模式，共同表明过去区与现在区之间真菌群落结构的明显转变。此外，属水平相对丰度条形图说明了菌塘发育阶段和非菌塘土壤间真菌群落组成的明显差异。过去区和现在区以松茸为主，而该属在未来区和对照土壤中相对丰度极低或几乎不存在。
α多样性分析显示，虽然α多样性指数无显著季节变异，但它们随松茸菌丝发育而显著不同。具体而言，未来区比过去区和现在区表现出更高的丰富度（ACE、Chao1和观察到的ASVs）和多样性（Shannon和Simpson指数），其水平与对照相似。这些结果表明菌塘内（过去区和现在区）真菌丰富度和多样性的减少可归因于松茸的优势地位。
α多样性指数与土壤性质之间的相关性热图显示，多样性指标与交换性钾呈强负相关，而其他土壤变量无明确关联。线性回归分析揭示了松茸相对丰度与交换性钾浓度之间的强正相关关系。
3.3. 细菌群落结构与环境
与真菌群落相反，基于16S rRNA基因的细菌群落分析表明，群落结构不受季节影响，但在菌塘阶段间差异显著。基于Bray-Curtis距离的PCoA揭示了按菌塘阶段的明显聚类，过去区与现在区和未来区清晰分离。PERMANOVA证实菌塘阶段对细菌群落组成有显著影响。在土壤变量中，水溶性铁（Fe）是唯一显著解释细菌群落变异的因子。
α多样性指数在季节或菌塘阶段间均无显著差异。这表明尽管在β多样性分析中观察到群落组成的转变，但细菌多样性和丰富度保持相对稳定。
属水平相对丰度条形图显示了菌塘发育阶段和对照土壤的细菌群落。过去区以埃达夫杆菌属（Edaphobacter）sp.的高相对丰度为特征，而现在区、未来区和对照土壤显示不同的细菌组成谱。条形图突出了菌塘发育过程中优势细菌类群的阶段依赖性变异。
3.4. 特定细菌类群与松茸的相互作用
SIMPER分析识别出埃达夫杆菌属（Edaphobacter）sp.和异酸杆菌属（Alloacidobacterium）sp.是导致相异性的主要贡献者，两者在过去区相对丰度较高。相反，诸如阿菲波菌属（Afipia）sp.、壤土地杆菌属（Chthoniobacter）sp.和假酸杆菌属（Pseudacidobacterium）sp.等类群在现在区显著富集。
4. 讨论
微生物群落在松茸菌塘阶段间的明显空间分化表明，菌塘发育深刻改变了周围土壤环境。这些差异表明松茸活动改变了活跃菌丝区的土壤环境，可能富集了特定养分。包括水溶性铁（Fe）、有效磷、电导率和交换性钾在内的化学梯度提示，松茸菌丝通过有机酸分泌、矿物风化和选择性营养吸收主动改变土壤营养动态。类似的微尺度风化和阳离子动员在菌丝-矿物界面已有报道，表明即使整体土壤营养浓度显示最小变异，真菌驱动的矿物转化仍可发生。
交换性钾与松茸丰度之间的强关系证实了钾可用性是真菌增殖的重要决定因子这一假说。我们的结果表明松茸对钾可用性响应敏感，可能利用或改变其菌塘环境内的钾动态。虽然整体交换性钾在区域间无显著差异，但过去-现在-未来的模式显示向活跃菌塘的细微但方向性的增加。这种微小但一致的梯度并非总能通过单变量均值比较检测到，但仍能构建真菌群落。这一解释得到我们的PERMANOVA支持，其中交换性钾是真菌组成的唯一显著环境预测因子，以及钾浓度与松茸丰度之间的强正相关关系。这些发现表明，即使钾可用性的适度增加（可能在菌丝圈内被放大）也能影响真菌竞争并促进松茸优势。
在钾丰富菌塘区观察到的真菌多样性减少与竞争排斥一致，其中密集的松茸菌丝垄断营养和物理空间，限制了腐生和非共生真菌的建立。这支持了宿主 specialization 与群落水平多样性之间的权衡假说，因为有利于松茸成功的生态策略同时减少了真菌共存。
与真菌群落相反，细菌组合与水溶性铁（Fe）有更强关联，突出了氧化还原驱动过程在塑造菌塘土壤细菌群落结构中的重要性。诸如慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）和伯克霍尔德菌属（Burkholderia）等铁载体生产类群在现在区的富集表明，这些细菌可能不仅耐受铁限制，而且积极参与铁动员。先前工作表明，根和菌丝相关细菌可显著贡献于矿物风化和铁溶解，从而增加真菌代谢必需的微量营养的可用性。这些发现与菌根辅助细菌（MHB）假说一致，该假说认为在营养限制条件下，合作的细菌-真菌相互作用可能增强外生菌根建立。
重要的是，几项研究为细菌促进松茸生长提供了直接实验支持。特定细菌分离物在共培养试验中增加了松茸菌丝生长，而菌塘相关细菌增强了营养动员并支持松茸生理活动。在我们的研究中，推定的MHB样类群包括慢生根瘤菌属和伯克霍尔德菌属相关群落在现在菌塘区富集。这与细菌-真菌反馈可能有助于松茸菌塘的维持、营养获取和持续发展的观点一致。
微生物演替模式进一步支持这一解释。偏好寡营养和酸性环境的酸杆菌门在过去区占主导，而富营养的变形菌门在现在区扩展，那里松茸代谢可能增加营养周转。变形菌门类群如慢生根瘤菌属和阿菲波菌属具有固氮和铁载体生产等功能性状，两者都可能增强松茸的营养可用性。与松茸活动相关的细菌组成的类似转变在其他森林系统中被观察到，共同表明松茸驱动的资源动态选择性促进或抑制特定细菌类群。
值得注意的是，真菌和细菌群落均未显示显著的季节性更替，且两组的α多样性在季节间保持稳定。这一发现与温带森林土壤中经常报告的明显季节性变化形成对比。一个合理的解释是松树-菌塘复合体产生了一个缓冲的微环境，减轻了温度、水分和营养可用性的季节性波动，从而稳定了菌塘土壤内的微生物多样性。密集的松茸菌丝和稳定的矿质土壤基质可能减弱菌丝圈内的气候变异。此外，我们的采样设计聚焦于单一森林类型和一致的土壤层，相对于更广泛的景观水平研究减少了生境异质性，可能限制了可检测的季节效应。
细菌α多样性在菌塘区域或季节间无变化，而β多样性随菌塘阶段显著不同。这一模式表明菌塘发育通过物种周转（而非总体丰富度变化）重组细菌群落组成。换句话说，类群正在被替换而非增加或丢失，表明沿菌塘梯度的环境过滤和生态位分化驱动了细菌组成转变而不影响总多样性。
综上所述，我们的结果表明松茸菌塘发育与陡峭的生物地球化学梯度相关，这些梯度明显重组了真菌和细菌群落。真菌组合主要响应交换性钾动态，而细菌组合则强烈受铁可用性和铁载体介导的相互作用影响。这种协调反应强调了在外生菌根系统中生物相互作用与土壤化学过程之间的紧密耦合。理解这些关系为理解松茸分布的生态机制及菌塘环境内微生物多样性的维持或衰退提供了关键见解。
