《SCIENCE ADVANCES》：PARP1 stabilizes FOXN3 to suppress pulmonary fibrosis through p38-related feedback regulation
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本研究针对肺纤维化中FOXN3蛋白不稳定的问题，揭示了PARP1通过其自身PARylation作用稳定FOXN3，进而抑制p38介导的FOXN3磷酸化降解，最终阻断Smad信号通路活化的新机制。研究人员发现肺特异性PARP1敲除会促进肺纤维化发展，而条件性过表达FOXN3可逆转此过程。该研究阐明了PARP1-FOXN3轴在肺纤维化中的关键抑制作用，为临床治疗提供了新的潜在靶点。
肺纤维化是一种慢性、进行性且通常致命的肺部疾病，其特征是肺组织中瘢痕组织的异常沉积，导致肺结构破坏和功能丧失。其中，特发性肺纤维化（IPF）最为常见，预后极差。转化生长因子-β（TGF-β）及其下游的Smad信号通路在肺纤维化的发生发展中扮演着核心角色，其异常活化会促进细胞外基质过度沉积和肌成纤维细胞活化。然而，调控这一通路的关键分子机制尚未完全阐明。
此前的研究发现，转录抑制因子叉头框N3（FOXN3）能够抑制Smad信号的转录活性，从而对抗肺纤维化。但问题是，FOXN3本身在促纤维化刺激（如TGF-β或博来霉素BLM）下会变得不稳定，迅速降解，从而失去其保护作用。这就引出了一个关键的科学问题：是否存在某种分子机制能够稳定FOXN3，使其在病理条件下持续发挥抑纤维化作用？为了回答这个问题，研究人员将目光投向了多聚ADP-核糖聚合酶1（PARP1）。
PARP1是PARP家族中最具特征的一员，参与DNA修复、转录调控等多种细胞过程。本研究旨在探究PARP1是否与FOXN3存在相互作用，以及这种相互作用是否在调控FOXN3稳定性和肺纤维化进程中发挥关键作用。研究成果发表在《SCIENCE ADVANCES》上。
为开展本研究，研究人员运用了多种关键技术方法，包括：免疫共沉淀（Co-IP）和GST pull-down验证蛋白质相互作用；染色质免疫共沉淀（ChIP）和CUT&Tag分析转录因子在基因组上的结合位点；利用CRISPR-Cas9技术构建基因敲除（KO）细胞系和条件性基因敲除小鼠模型；通过肺特异性腺病毒递送Cre重组酶实现体内基因操作；使用蛋白质印迹（Western blot）、免疫荧光、定量PCR（qPCR）和酶联免疫吸附试验（ELISA）进行分子和表型分析；以及组织学染色（如H&E和Masson trichrome）评估肺纤维化程度。临床样本来源于确诊的肺纤维化患者。
FOXN3和PARP1在基因启动子区域显著共定位
研究人员通过质谱分析重新筛选FOXN3的相互作用蛋白，发现PARP1与FOXN3存在强烈相互作用，并通过内源性和外源性Co-IP实验进行了验证。免疫荧光实验显示FOXN3和PARP1在细胞核内显著共定位。缺失作图实验表明，FOXN3的叉头DNA结合域是其与PARP1相互作用的关键区域。体外GST pull-down实验进一步证实了两者之间存在直接相互作用。更重要的是，通过CUT&Tag技术分析基因组结合谱，发现FOXN3和PARP1在8536个基因的启动子区域存在共定位，其中包括TGF-β信号通路等多个与纤维化相关的通路，提示两者在调控Smad信号方面具有密切的功能联系。
PARP1稳定FOXN3以阻碍Smad信号
在促纤维化刺激下，PARP1和FOXN3的蛋白水平均显著下降。利用CRISPR-Cas9技术敲除A549细胞中的PARP1，或通过siRNA敲低PARP1，均加速了FOXN3的降解。在体内实验中，肺特异性敲除PARP1同样导致FOXN3蛋白水平降低。有趣的是，PARP1并不能直接催化FOXN3发生PARylation修饰，但其自身的自动PARylation活性对于稳定FOXN3至关重要。使用PARP1催化活性抑制剂BYK204165或PJ34处理细胞，会抑制蛋白PARylation水平，进而促进FOXN3降解，并削弱FOXN3在Smad应答基因元件上的占据，最终导致Smad信号转录激活。在PARP1敲除细胞中重新引入野生型PARP1，而非催化失活突变体E988A，能够显著抑制Smad信号的转录活性。这些结果表明，PARP1通过其自动PARylation作用稳定FOXN3，从而抑制Smad信号的转录激活。
肺特异性PARP1敲除促进肺纤维化
为了探究PARP1在肺纤维化中的作用，研究人员构建了肺特异性PARP1条件性敲除小鼠模型。RNA测序分析显示，PARP1敲除后，大量Smad信号下游的促纤维化调节因子表达上调。组织学染色（ trichrome和H&E）分析表明，PARP1敲除增强了小鼠肺部的促纤维化和促炎症反应。支气管肺泡灌洗液（BALF）ELISA检测发现促炎细胞因子水平显著升高。此外，PARP1缺失还导致总胶原含量增加（通过羟脯氨酸测定），诱导肺泡II型上皮细胞凋亡和肌成纤维细胞分化（α-SMA阳性细胞增多），从而加速肺纤维化的病理发展。
FOXN3是PARP1介导的肺纤维化和Smad信号转录活性所必需的
为了确认PARP1介导的肺纤维化是否依赖于FOXN3，研究人员将PARP1条件性敲除小鼠与FOXN3条件性过表达（LSL-KI）小鼠杂交。结果发现，重新引入FOXN3能够有效阻止由PARP1缺失加剧的肺纤维化，表现为胶原沉积减少、炎症反应减轻以及促纤维化因子表达下降。然而，FOXN3过表达主要抑制了PARP1缺失引起的肌成纤维细胞活化，对肺泡上皮细胞损伤的改善作用不明显。在细胞实验中，在PARP1敲除的A549细胞中重新表达野生型FOXN3（而非其DNA结合域缺失突变体ΔF），能够抑制Smad2/3/4复合体与其靶基因元件的结合，从而抑制Smad信号的转录活性。这证明FOXN3是PARP1抑制肺纤维化及其调控Smad信号的关键效应蛋白。
p38是一个受PARP1/FOXN3抑制复合体转录抑制的Smad应答基因
之前的研究表明，p38激酶能够磷酸化FOXN3的第83和85位丝氨酸（S83/S85），导致其降解。本研究发现，在促纤维化刺激下，FOXN3的S83/S85磷酸化水平以及p38本身的表达均随时间推移而显著增加。抑制或敲除PARP1会导致p38的蛋白和RNA水平显著上升，进而促进FOXN3的S83/S85磷酸化。CUT&Tag和ChIP分析揭示，PARP1和FOXN3共同结合在p38基因的启动子区域，并且Smad4也在此区域富集，表明p38本身可能是一个Smad应答基因。当PARP1被抑制或敲除后，FOXN3在p38启动子区域的招募减少，而Smad蛋白的结合增加，导致p38转录上调。这表明PARP1/FOXN3复合物通过抑制Smad信号对p38的转录激活，从而负调控p38的表达。
受PARP1/FOXN3复合物转录抑制的p38通过反馈机制增强FOXN3稳定性并调节Smad信号
由于p38的表达受PARP1/FOXN3复合物抑制，而p38又能磷酸化降解FOXN3，研究人员推测存在一个反馈调节环路。实验证实，敲低p38或使用p38抑制剂SB 203580处理，能够增加FOXN3的蛋白水平，并抑制其S83/S85磷酸化。同时，p38的敲低减少了Smad2/3/4复合体在其靶基因元件上的结合，增强了FOXN3在这些位点的占据，最终导致Smad信号转录抑制。这表明，由PARP1/FOXN3复合物抑制的p38低表达，能够通过正反馈机制稳定FOXN3，进而阻碍Smad转录激活。PARP1如同一个分子开关，控制着这个正反馈环路，防止FOXN3发生磷酸化依赖性降解。
破坏FOXN3 S83和S85磷酸化可抑制PARP1缺失诱导的肺纤维化
为了验证上述磷酸化事件在肺纤维化中的关键作用，研究人员将PARP1条件性敲除小鼠与FOXN3 S83/S85磷酸化位点突变（KI/KI，突变为丙氨酸）小鼠杂交。结果显示，阻断S83/S85磷酸化能够显著提高PARP1敲除背景下FOXN3的总蛋白水平，并有效抑制由PARP1缺失引发的肺纤维化、炎症反应、促纤维化因子表达升高以及胶原沉积。这强有力地证明，PARP1缺失所加剧的肺纤维化严重依赖于p38介导的FOXN3 S83/S85磷酸化事件。
PARP1和FOXN3的表达水平与临床肺纤维化负相关
最后，研究人员分析了临床肺纤维化患者样本。免疫组织化学染色结果显示，与癌旁正常组织相比，纤维化病变区域中PARP1和FOXN3的蛋白表达水平均显著降低。这一发现将基础研究结果与临床疾病联系起来，强调了PARP1-FOXN3轴在人类肺纤维化发生发展中的潜在重要性。
研究结论与意义
本研究揭示了一个全新的调控肺纤维化的分子环路。PARP1通过与FOXN3直接相互作用，并依赖其自身PARylation活性，稳定FOXN3蛋白。PARP1/FOXN3复合物进而转录抑制p38的表达，而p38作为Smad应答基因，其低表达状态通过反馈机制减少了对FOXN3的磷酸化和降解，从而维持FOXN3的稳定性，持续抑制Smad信号的过度活化。当PARP1缺失时，这个保护性环路被破坏：p38表达上调，导致FOXN3磷酸化降解，Smad信号失控，最终驱动肺纤维化进程。
该研究不仅阐明了PARP1在肺纤维化中此前未被认识到的抑制功能，还深入解析了其通过调控FOXN3稳定性发挥作用的具体机制，并揭示了一个涉及p38的关键反馈环路。这些发现为理解肺纤维化的发病机制提供了新的理论框架，并指出PARP1-FOXN3轴以及干预FOXN3磷酸化（如使用p38抑制剂）可能成为未来治疗肺纤维化的潜在新策略。
