《DNA Research》：Giant linear plasmids in Mycobacterium avium harbor a tRNA array unit
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本研究针对非结核分枝杆菌(NTM)中tRNA阵列单元的基因组定位不明确问题，通过混合测序和脉冲场凝胶电泳技术，首次实验证实鸟分枝杆菌携带300kb以上的巨型线性质粒。研究发现这些"反转子"型质粒编码新型T7/4SS分泌系统(ESX-P5)，且在日本分离株中呈现地域特异性分布，为NTM质粒进化研究提供了新视角。
在微生物研究领域，非结核分枝杆菌(Nontuberculous mycobacteria, NTM)正日益成为全球公共卫生的重要挑战。这些环境中的机会性病原体能够引起慢性肺部疾病，甚至对免疫功能正常的个体也构成威胁。其中，鸟分枝杆菌复合体(Mycobacterium avium complex, MAC)是全球呼吸道标本中最常见的NTM物种之一。尽管基因组学研究已发现NTM偶尔携带称为tRNA阵列单元的特殊基因簇——这被认为是一种潜在的抗防御系统，但这些单元在基因组中的精确位置及其生物学意义始终成谜。
为了解决这一科学问题，由日本国立感染症研究所的Hirokazu Yano领导的研究团队开展了针对鸟分枝杆菌中巨型线性质粒的系统研究。研究人员选取了5株携带tRNA阵列单元的鸟分枝杆菌亚种hominissuis菌株（其中2株分离自MAC肺病患者，3株来自健康志愿者家庭的浴室），采用长短读长混合测序结合脉冲场凝胶电泳(Pulse-Field Gel Electrophoresis, PFGE)等技术，成功解析了这些菌株的完整基因组结构。这项发表于《DNA Research》的研究，首次提供了鸟分枝杆菌携带巨型线性质粒的实验证据，为理解NTM基因组可塑性提供了新视角。
关键技术方法
研究采用混合测序策略（PacBio长读长和Illumina短读长），通过Unicycler(v.0.4.8)进行基因组组装，并利用PFGE和SDS-PFGE验证线性质粒拓扑结构。通过比较基因组学分析314个分枝杆菌质粒的基因组成，使用PHMMER鉴定ESX分泌系统基因，采用ClonalFrameML进行重组感知的系统发育分析。样本包括2株临床分离株和3株环境分离株。
研究结果
3.1. tRNA阵列单元中的tRNA基因
研究发现鸟分枝杆菌亚种hominissuis中的tRNA阵列单元可分为A-D四种类型，每种包含26-27个tRNA基因，对应19-20种氨基酸的密码子。这些tRNA的密码子与染色体编码的tRNA存在冗余，但其核苷酸序列存在差异，特别是在反密码子环区域。所有四种类型的阵列单元中都保守存在一个HNH内切核酸酶编码基因。
3.2. 鸟分枝杆菌线性复制子的端到端序列
通过混合组装和末端序列优化，研究获得了5个长度超过300kb的完整线性复制子序列：pS2b(348,162bp)、pBA018a(366,138bp)、pPPE_S58a(456,679bp)、pBA059a(344,653bp)和pBA705a(308,290bp)。这些线性复制子两端均含有约415bp的末端反向重复序列(Terminal Inverted Repeats, TIRs)和5'端的poly-C核苷酸序列，表现出典型的"反转子"(invertron)特征。
3.3. 线性复制子为线性质粒
拷贝数分析显示这些线性复制子在细胞中的数量约为1.0-1.5个/染色体，表明其具有拷贝数控制功能。基因组成分析鉴定出324个蛋白质编码基因家族，包括编码VII型/IV型分泌系统(T7/4SS)、ParA型ATPase、多种肽酶和螺旋酶的核心基因。与已知的分枝杆菌接合质粒不同，这些线性质粒缺乏松弛酶(relaxase)基因，提示其可能采用独特的水平转移机制。
3.4. pS2b型线性质粒的ESX-P基因座
研究发现这些线性质粒携带一个新型的T7/4SS基因座，被命名为ESX-P5。与pRAW相关质粒中的ESX-P1相比，ESX-P5在基因排列和序列同一性（约30%）方面存在显著差异。系统发育分析表明，ESX-P5与来自胞内分枝杆菌亚种chimaera和Mycolicibacterium sp.的质粒中的ESX基因座有共同祖先，表明其起源于分枝杆菌目中的可转移元件。
3.5. pS2b型线性质粒与其他NTM质粒的基因组成相似性
与309个RefSeq中的NTM质粒比较显示，pS2b型线性质粒是第二大的质粒基因组群。tRNA阵列单元仅存在于大于200kb的大型质粒中，且松弛酶基因在推测的线性质粒中较为罕见，这可能作为线性NTM质粒的一个识别特征。
3.6. pS2b型线性质粒在鸟分枝杆菌复制子中的特征
功能类别分析表明，线性质粒中与转座子相关的X类功能最为丰富，插入序列(IS)密度也最高（2.6-4.6拷贝/100kb），显著高于染色体和pMAH135型环状质粒。
3.7. pPPE_S58a中的153kb岛屿
在pPPE_S58a中发现一个独特的153kb区域，包含MCE操纵子、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因、lpqH同源基因等与脂质代谢相关的基因。该区域与副戈登分枝杆菌(Mycobacterium paragordonae)的环状质粒和清濑分枝杆菌(Mycobacterium kiyosense)的contig存在同源性，表明大型DNA片段在NTM质粒间的易位现象。
3.8. pS2b型线性质粒在鸟分枝杆菌亚种hominissuis中的分布
对193个基因组的分析显示，17个菌株(8.8%)携带与pS2b高度相似的eccA和eccB基因，其中14个同时含有A型tRNA阵列单元。这些菌株主要属于东亚特有的EA1和EA2亚群，且绝大多数分离自日本，表明pS2b型线性质粒具有地理分布偏向性。
研究结论与意义
本研究首次通过实验证实鸟分枝杆菌携带巨型线性质粒，这些质粒具有典型的反转子特征：蛋白封端的末端、末端反向重复和5'端poly-C序列。研究发现这些线性质粒携带一个新型的ESX-P5分泌系统基因座和tRNA阵列单元，且在日本分离株中呈现明显的地理分布偏向性。
该研究的科学意义在于：首先，它扩展了我们对NTM基因组结构的认识，揭示了线性质粒在鸟分枝杆菌中的存在和多样性；其次，研究建立的混合组装技术为准确解析含有线性元件的细菌基因组提供了方法学参考；最后，发现pS2b型线性质粒的地域特异性分布为研究NTM的进化和传播提供了新的视角。
从临床角度看，理解质粒携带的基因（如那些可能参与脂质代谢和潜在毒力因素的基因）对于阐明鸟分枝杆菌的致病机制具有重要意义。此外，tRNA阵列单元作为可能的抗防御系统元件，其在不同分枝杆菌质粒间的分布可能影响细菌对环境压力的适应能力。
这项研究不仅为鸟分枝杆菌的基因组学研究提供了五个高质量的参考基因组，也为未来NTM测序项目中的数据分析和解读建立了重要基础。随着更多NTM基因组的解析，我们有望更深入地理解这些环境病原体的进化动态和适应机制。
