传染性胃肠炎病毒基因组RNA中的N6-甲基腺苷通过RIG-I高效识别抑制病毒复制

《Journal of Virology》：N6-methyladenosine within transmissible gastroenteritis virus genomic RNA inhibits its replication via efficient recognition by RNA sensor RIG-I

本研究揭示了N6-甲基腺苷（m6A）修饰在传染性胃肠炎病毒（TGEV）基因组RNA中的关键抗病毒机制。通过实验证实，m6A修饰通过YTHDF2 reader蛋白降低病毒RNA稳定性，并激活RIG-I（Retinoic acid-inducible gene I）介导的干扰素（IFN）信号通路，从而抑制病毒复制。该发现为宿主-病毒相互作用中m6A的双重调控功能提供了新见解。

　　

ABSTRACT

N6-甲基腺苷（m⁶A）是真核生物RNA中最丰富的内部修饰，在RNA代谢中发挥多种作用。本研究以传染性胃肠炎病毒（TGEV）为模型，探讨m⁶A在病毒感染中的抑制作用。研究发现，TGEV基因组RNA存在m⁶A修饰，且该修饰通过reader蛋白结合病毒RNA并降低其稳定性。值得注意的是，TGEV感染会提高宿主RNA的整体m⁶A水平，尤其是在干扰素（IFN）相关基因中。抑制m⁶A甲基化会显著削弱IFN基因表达。此外，与其他病毒相比，TGEV基因组RNA具有异常高的m⁶A比例，可被RIG-I识别以促进免疫反应。综上，高m⁶A修饰通过增强RIG-I对TGEV RNA的识别，激活IFN反应并抑制病毒复制。

INTRODUCTION

m⁶A修饰由甲基转移酶（如METTL3/METTL14）、去甲基化酶（如FTO）和reader蛋白（如YTHDF家族）动态调控。尽管m⁶A在多数病毒中促进复制，但在黄病毒科（Flaviviridae）和冠状病毒科（Coronaviridae）成员中却呈现抑制作用。TGEV作为冠状病毒科的模式病毒，其基因组结构为典型冠状病毒排列（5′UTR–ORF1a/1b–S–ORF3a/3b–E–M–N–NS7–3′UTR）。本研究旨在阐明m⁶A在TGEV复制及免疫识别中的具体机制。

MATERIALS AND METHODS

实验采用PK-15细胞系及TGEV-H和TGEV-QY18毒株。通过m⁶A-seq、RNA免疫共沉淀（RIP）、dot blot、ELISA及CRISPR/Cas9基因敲除等技术，分析m⁶A修饰分布、病毒复制效率及免疫通路激活。抑制剂3-DAA和STM2457用于调控甲基化水平。

RESULTS

TGEV基因组RNA存在m⁶A甲基化修饰

从纯化病毒颗粒中提取的TGEV RNA显示显著高于体外转录（IVT）RNA的m⁶A水平（约0.065%–0.078%）。m⁶A-seq鉴定出6个显著峰，分布于ORF1a、S、M、N和NSP7区域。3-DAA处理使m⁶A比例降至约0.05%，且M和N/NSP7区域的富集分数明显下降。

m⁶A甲基化抑制TGEV复制

低浓度3-DAA（0.1–1 μM）处理显著增强病毒复制（提高超100倍），斑块实验显示斑块数量和尺寸增加。敲低METTL3/14降低m⁶A水平并促进病毒复制，而敲低FTO则相反。过表达FTO进一步升高病毒滴度。亚细胞定位显示，TGEV感染诱导METTL3、METTL14和FTO从核内转移至胞质，表明修饰过程发生于胞质。

m⁶A reader蛋白负调控TGEV复制

YTHDF1–3均能结合TGEV RNA（富集超100倍）。敲低YTHDFs增强病毒复制，过表达则抑制复制。YTHDF2通过促进m⁶A修饰的病毒RNA降解降低其稳定性，Remdesivir处理验证该机制。

TGEV感染改变宿主m⁶ARNA甲基化模式

感染后宿主总RNA的m⁶A水平升高，峰值出现于24 hpi，且依赖病毒复制。Western blot显示FTO上调、METTL3下调。m⁶A-seq揭示感染后修饰峰向3′-UTR区域聚集，提示基因表达调控功能增强。

m⁶A修饰激活干扰素信号通路

GO和KEGG分析显示m⁶A富集于RNA代谢及病毒感染通路。双荧光素酶报告实验证实TGEV感染激活NF-κB、IRF3和IFN-β启动子，且3-DAA或STM2457处理抑制此激活。qPCR和Western blot验证IFN-λ1、IFN-λ3、RIG-I及p-IRF3表达受m⁶A调控。

RIG-I识别m⁶A修饰的TGEV RNA

RIP和RNA pull-down实验表明RIG-I优先结合高m⁶A的TGEV RNA，且结合强度随3-DAA处理降低。RIG-I敲除（KO）细胞中，3-DAA对病毒复制的促进作用消失，证实RIG-I介导m⁶A依赖性识别。此外，RIG-I KO细胞中宿主m⁶A水平变化减弱，提示其参与反馈调控。

TGEV RNA的高m⁶A水平促进RIG-I识别

TGEV RNA的m⁶A比例（约0.07%）高于副流感病毒（PIV，约0.06%）和宿主RNA（约0.04%）。高m⁶A密度直接增强RIG-I结合，而接近宿主水平的病毒RNA结合较弱。

DISCUSSION

本研究揭示m⁶A通过YTHDF2介导的RNA destabilization和RIG-I驱动的先天免疫激活双重机制抑制TGEV复制。病毒基因组长度（>28 kb）和高m⁶A密度共同增强其免疫原性。与多数病毒不同，TGEV感染诱导甲基化酶胞质转位，直接修饰病毒RNA。研究强调m⁶A功能的多因素依赖性，包括病毒家族、基因组特性及宿主环境，为靶向m⁶A的抗病毒策略提供理论依据。

ACKNOWLEDGMENTS

研究受甘肃省基础研究创新组项目、联合基金及自然科学基金资助。