《Bioactive Materials》：Supramolecular helicity dependent osteogenesis and angiogenesis crosstalk of periodontal ligament stem cell
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本研究针对牙周组织再生中干细胞定向分化调控难题，创新性地构建了具有手性依赖超分子螺旋结构的纳米纤维。通过L/D-谷氨酸衍生物与吡嗪共组装体系，首次揭示了左旋螺旋纤维(L2)可通过整合素α5β1-FAK-ERK-YAP/RUNX2信号轴促进PDLSCs成骨分化，并激活Piezo1-HIF-1α-VEGF通路诱导血管生成。该研究为基于牙源性干细胞的骨再生治疗提供了新材料设计策略和机制理论基础。
在组织工程与再生医学领域，有效组织再生的两大支柱是多能干细胞和指导分化的基质材料。细胞外基质的手性作为影响干细胞命运的关键结构特征，其作用机制尚未完全阐明。特别是对于牙周膜干细胞（PDLSCs）这一安全易得的干细胞来源，分子手性和超分子螺旋性如何影响其分化仍属科学前沿的未解之谜。传统研究多通过圆二色谱等光学方法表征手性，但由于材料体系和表征技术的限制，形态学表征往往不尽如人意。更值得注意的是，近期研究表明光学手性并不等同于形态螺旋性，这使得超分子螺旋性的生物学功能研究更具挑战性。
针对这一科学问题，河北医科大学邓旭亮教授团队在《Bioactive Materials》上发表了创新性研究成果。研究团队设计合成了一对手性谷氨酸衍生物对映体（L/D-GC18），通过与桥联分子吡嗪共组装构建了具有化学生计量依赖性螺旋结构的纳米纤维。令人惊喜的是，当L-GC18与吡嗪以1:2比例组装时，形成了左旋螺旋结构（L2），而D-GC18在相同条件下则形成右旋螺旋（D2）。
研究团队采用原子力显微镜（AFM）和冷冻电镜（cryo-EM）对纳米纤维的形貌进行表征，通过傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和X射线衍射（XRD）分析分子排列方式。体外实验表明，左旋L2纤维能显著促进PDLSCs的成骨分化，上调RUNX2、BMP2、OCN等成骨标志物表达，并增强碱性磷酸酶（ALP）活性和钙结节形成。
在机制探索方面，研究人员通过RNA测序分析发现，L2处理2小时即可激活PDLSCs中与细胞粘附、整合素信号和机械刺激反应相关的基因表达。进一步实验证实，L2纤维通过整合素α5β1-fibronectin（FN）结合触发机械转导信号，促进黏着斑激酶（FAK）和细胞外信号调节激酶（ERK1/2）磷酸化，诱导YAP核转位并与RUNX2协同激活成骨基因表达。
更有趣的是，研究还揭示了L2纤维通过Piezo1介导的钙离子内流，激活HIF-1α依赖性VEGF分泌，从而促进血管生成的旁分泌机制。这种成骨-血管生成耦合效应在大鼠颅骨缺损和牙槽骨缺损模型中均得到验证，显微CT（micro-CT）显示PDLSCs@L2组骨体积分数（BV/TV）显著高于对照组，组织学染色证实新生骨组织具有更成熟的骨小梁结构和更高的血管密度。
关键技术方法包括：手性纳米纤维的分子设计与自组装制备、原子力显微镜与冷冻电镜形貌表征、RNA测序与生物信息学分析、蛋白质印迹（Western blot）与免疫荧光检测、Micro-CT三维重建与骨形态计量分析、光学相干断层扫描血管成像（OCTA）等。动物实验使用Wistar大鼠建立颅骨和牙槽骨缺损模型，样本来源于河北医科大学实验动物中心。
2.1. 具有化学计量依赖性螺旋性的纳米纤维设计与表征
通过L/D-GC18与吡嗪的共组装，成功构建了螺旋结构可控的纳米纤维。当氨基酸衍生物与桥联分子比例为1:2时，L-GC18形成左旋纤维，D-GC18形成右旋纤维。FT-IR和XRD分析表明吡嗪分子通过氢键有序排列在L/D-GC18分子之间，形成复合双层结构。
2.2. 超分子螺旋性和分子手性协同调控体内成骨-血管生成耦合
将经不同手性纤维预处理的PDLSCs植入大鼠颅骨缺损处，Micro-CT显示左旋L2纤维组（PD@L2）骨再生效果最佳，骨体积分数显著高于其他组。OCTA血管成像显示PD@L2组在术后14天血管密度、面积和直径均显著增加，CD31免疫荧光证实血管网络更密集。
2.3. 螺旋依赖性PDLSCs成骨分化及由此产生的血管生成
体外实验证实L2纤维能显著上调PDLSCs成骨标志物表达，促进矿化结节形成。条件培养基实验表明L2的促血管生成作用主要通过激活PDLSCs的旁分泌功能实现，而非直接作用于内皮细胞。
2.4. 螺旋依赖性机械转导通路激活
RNA测序显示L2处理2小时即可激活整合素介导的机械转导通路。免疫荧光和Western blot证实L2促进整合素α5β1-FN-纽蛋白（vinculin）信号轴激活，这一过程被整合素抑制剂Cilengitide所阻断。
2.5. 左旋L2纤维通过FAK-ERK-YAP/RUNX2机械转导信号轴促进成骨
L2纤维通过整合素α5β1激活FAK-ERK信号通路，促进YAP核转位并与RUNX2协同调控成骨基因表达。细胞骨架抑制剂Latrunculin A能逆转这一效应，表明细胞骨架张力在机械信号传递中起关键作用。
2.6. 左旋L2纤维通过Piezo1-HIF-1α-VEGF旁分泌信号轴刺激血管生成
钙成像显示L2能快速诱导PDLSCs内钙离子浓度升高，这一效应被Piezo1抑制剂GsMTx4所抑制。L2通过Piezo1-HIF-1α轴促进VEGF分泌，为血管生成提供必要的旁分泌信号。
2.7. L2-PDLSCs复合物在牙周骨再生中的治疗应用
在大鼠牙槽骨缺损模型中，PD@L2组显示骨缺损高度显著降低，骨体积分数随时间推移持续增加。组织学分析显示新生骨组织排列致密，免疫组化证实成骨标志物BMP2、OCN和血管标志物CD31表达均显著上调。
该研究首次系统阐明了超分子螺旋性调控PDLSCs成骨-血管生成耦合的分子机制，为基于牙源性干细胞的骨再生治疗提供了新思路。左旋L2纤维通过整合素α5β1-FAK-ERK-YAP/RUNX2轴促进成骨分化，同时激活Piezo1-HIF-1α-VEGF通路诱导血管生成，这种双重调控作用显著增强骨再生效果。研究不仅证实了PDLSCs作为易得、低免疫原性干细胞来源的治疗潜力，更创新性地将超分子手性设计引入干细胞微环境调控领域，为下一代再生医学材料开发提供了新范式。
