《Biomaterials》：Extracellular vesicles secreted by LRP1+ ligament-derived stem cells promote tendon-bone healing after ACL reconstruction via miR-708-5p/Bambi axis
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提升骨腱接口再生：LRP1+韧带干细胞外泌体通过miR-708-5p/Bambi轴调控软骨分化（
中南大学湘雅医院运动医学系，长沙，410008，中国
摘要
前交叉韧带（ACL）断裂通常需要重建手术，术后面临的关键挑战是移植组织与骨隧道之间的牢固整合。研究表明，间充质干细胞（MSCs）分泌的细胞外囊泡（EVs）可以增强肌腱-骨愈合的强度。作为ACL中的组织驻留干细胞，韧带源性干细胞（LDSCs）在损伤后是最早被激活的细胞之一，它们会迁移到受损部位参与再生修复。本研究通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）发现，LRP1阳性的LDSCs（LRP1
+LDSCs）比LRP1阴性的LDSCs具有更强的干性和成软骨分化潜能。基于此，我们从LRP1
+LDSCs中分离出EVs（LRP1
+LDSCs-EVs），并利用明胶甲基丙烯酸酯（GelMA）水凝胶作为载体将其输送到大鼠ACL重建（ACLR）模型的骨隧道中。结果显示，LRP1
+LDSCs-EVs有效促进了ACLR后肌腱-骨界面（TBI）的软骨再生，并显著改善了生物力学功能的恢复。miRNA测序进一步分析了LRP1
+LDSCs-EVs中的miRNA成分，发现miR-708-5p是关键调控因子。该miRNA直接结合并抑制Bambi mRNA的表达，从而减少Bambi蛋白对BMP信号通路的竞争性抑制（Bambi作为TGF-β通路的诱饵受体）。这一机制激活了成软骨分化，促进了TBI的再生愈合。总体而言，来自LRP1阳性LDSCs亚群的EVs显著提高了ACLR后的移植组织与骨隧道的整合效率，为骨科手术中增强肌腱-骨整合提供了一种新的靶向且高效的无细胞治疗策略。
引言
肌腱-骨界面（TBI）的愈合在骨科和运动医学中是一个重要的临床挑战，影响着前交叉韧带（ACL）重建、旋转袖修复和跟腱重建等手术的疗效[1]、[2]、[3]、[4]。这些手术中TBI愈合不足常常导致持续疼痛、功能障碍以及手术失败风险增加[5]、[6]。ACL损伤是膝关节最常见的疾病之一[7]，尤其是在运动员中，流行病学数据显示普通人群中ACL损伤率为每10万人年30-78例，而运动员中则为每10万人年150-370例[8]、[9]。前交叉韧带重建（ACLR）是目前的标准治疗方法，通过将肌腱移植组织固定在骨隧道中来恢复膝关节功能[10]。尽管进行了手术干预，一些患者仍可能出现术后并发症，如骨关节炎（OA）和软骨退化，以及移植相关的挑战，如肌腱-骨愈合不良或移植失败，这可能阻碍患者恢复到受伤前的活动水平，有时甚至需要再次手术[11]、[12]。这些临床问题主要源于关键的肌腱-骨界面（TBI）愈合不良，ACLR诱导的纤维血管疤痕组织无法模拟天然纤维软骨的过渡，导致整合效果较差，移植失败风险增加[13]、[14]、[15]、[16]、[17]。
为了解决这一未满足的临床需求，再生医学的最新进展表明，间充质干细胞（MSCs）由于其增殖能力、自我更新能力和多向分化潜能（成骨、成软骨、成腱）[18]、[19]、[20]、[21]而展现出广阔的治疗潜力。值得注意的是，从ACL中分离出的韧带源性干细胞（LDSCs）在成腱和成软骨分化方面优于骨髓源性干细胞（BMSCs）和脂肪源性干细胞（ADSCs）[22]、[23]、[24]、[25]、[26]。作为天然适应韧带微环境的组织驻留干细胞，LDSCs在修复过程中能够迅速激活并迁移到损伤部位[27]、[28]。这些独特特性使LDSCs成为TBI再生的理想候选细胞。
尽管LDSCs为TBI修复提供了有前景的治疗途径，但其临床应用仍受到有限研究的限制。关键在于，与其他MSC亚群一样，LDSCs在不同亚群间可能存在功能异质性。目前对LDSCs亚群分类和功能特性的理解尚不全面，这不仅阻碍了对其生物学特性的精确解析，也影响了关键治疗靶点的系统识别。肌腱-骨界面处的纤维软骨层主要起到缓解应力集中、促进拉伸负荷从柔软肌腱向坚硬骨骼逐渐过渡的作用，从而降低界面处失败的风险[30]。因此，促进ACLR后的纤维软骨再生对于实现移植组织与骨隧道的牢固整合至关重要。为了识别具有更强成软骨能力的LDSC亚群，我们关注了低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP1）——该蛋白属于低密度脂蛋白受体（LDLR）基因家族——基于先前的研究，该蛋白在肌肉骨骼发育和疾病过程中的骨再生和重塑中起重要作用[31]。在软骨细胞中，LRP1通过抑制与软骨退化相关的酶来促进关节软骨的存活[32]，同时通过促进生长板增殖软骨细胞的CCN2内吞作用来促进成软骨分化[33]。
尽管细胞疗法具有优势，但仍存在免疫排斥、肿瘤发生和血栓栓塞等风险[34]。鉴于对基于MSCs的疗法的安全性担忧，以及已知MSCs主要通过旁分泌机制发挥作用，细胞外囊泡（EVs）已成为治疗开发的有希望的替代方案[35]、[36]、[37]。EVs是通过胞吐作用释放的双膜囊泡，携带多种生物活性物质，如信使RNA（mRNAs）、microRNAs（miRNAs）、信号蛋白和脂质[38]。这些囊泡通过传递miRNAs和蛋白质来调节受体细胞的功能和基因表达[39]。重要的是，MSCs来源的EVs具有类似干细胞的生物学特性，包括组织修复和免疫调节能力[40]。因此，EVs代表了传统细胞疗法的有前景的无细胞替代方案。最近使用BMSCs、ADSCs和肌腱源性干细胞（TDSCs）来源的EVs的研究进一步验证了它们在促进TBI愈合方面的有效性[41]、[42]、[43]、[44]。
因此，本研究利用大鼠模型探讨了LRP1+韧带源性干细胞-EVs（LRP1+LDSCs-EVs）在ACLR后TBI愈合中的作用。我们首先通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析验证了人类受伤ACL中LRP1+LDSCs亚群的存在，然后通过荧光激活细胞分选成功分离出大鼠ACL中的LRP1+LDSCs。利用基于水凝胶的细胞外囊泡递送系统的可控释放优势[45]、[46]，我们建立了大鼠ACLR模型，并将载有LRP1+LDSCs-EVs的明胶甲基丙烯酸酯（GelMA）水凝胶注入骨隧道，以确定LRP1+LDSCs-EVs是否能通过促进软骨组织形成来增强移植组织与骨隧道的整合。此外，我们还阐明了LRP1+LDSCs-EVs介导TBI修复的分子机制，确定了miR-708-5p/Bambi轴在此过程中的关键调控作用。我们的结果表明，LRP1+LDSCs-EVs显著促进了ACL重建后的TBI功能恢复。
单细胞RNA测序发现促进成软骨再生的LRP1+LDSCs亚群
利用我们之前建立的包含不同损伤阶段人类ACL样本的scRNA-seq数据库，本研究系统地表征了人类LRP1+LDSCs的生物学特性和时空动态。初步分析显示，所有人类ACL细胞中的LRP1表达分布与干性相关基因的空间分布高度相关（图1A）。为了研究LRP1+细胞在韧带和膝关节内的定位...
讨论
虽然先前的研究已经证实了LDSCs在其他间充质来源中的再生优势[22]、[26]，但亚群分类和机制机制的不确定性限制了其临床应用。为了解决这一问题，我们利用scRNA-seq鉴定出一个具有更强干性和显著成软骨潜能的LDSCs亚群，将其命名为LRP1+LDSCs。后续实验表明，LRP1+LDSCs-EVs显著增强了ACL的TBI愈合...
结论
总之，研究结果表明，LRP1+LDSCs-EVs增强了ACLR后的TBI处纤维软骨再生，并促进了移植周围骨的形成和重塑，从而改善了TBI愈合。功能分析显示，LRP1+LDSC-EVs通过将miR-708-5p传递给BMSCs来发挥这些作用，后者抑制了Bambi的过度表达，进而促进了BMSCs的成软骨分化，促进了TBI处的纤维软骨再生。
单细胞转录组数据的生物信息学分析
利用我们实验室现有的ACL残余组织的scRNA-seq数据，比较了LRP1+LDSCs和LRP1-LDSCs的干性、功能特性和多向分化潜能（成软骨、成骨、成脂）。该研究方案已获得中南大学湘雅医院伦理委员会的批准（编号202307601）。所有九名ACL损伤参与者均了解了研究目的并签署了书面知情同意书。
作者贡献声明
Shen Liu：验证、方法学、数据分析。Yiyang Mao：验证、方法学、数据分析。Linfeng Wang：数据可视化、方法学。Ruixue Du：方法学。Yiting Xu：数据可视化。Chengjun Li：撰写、审稿与编辑、项目管理、资金获取。Hongbin Lu：撰写、审稿与编辑、资源管理、项目管理、资金获取。Tao Zhang：撰写、审稿与编辑、项目管理、资金获取。
数据可用性声明
支持本研究结果的数据可向通讯作者索取。
资金声明
本研究得到了以下机构的资助：国家自然科学基金（编号82572851、82230085、82503086）、国家重点研发计划（2022YFC2010204）、中南大学的基本科研业务费（2025ZZTS0868）、湖南省自然科学基金（2024JJ6637）以及湘雅医院青年研究员基金（2023Q05）。
利益冲突声明
? 作者声明没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢中南大学湘雅医院运动系统损伤与修复研究中心的Hui Xie教授及其他工作人员在实验中的协助，同时也感谢中南大学高等研究院生物医学中心的Hongkang Zhou教授在实验中的帮助。
